Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

Jacobs, N. L., Albertson, R. C., Wiles, J. R. Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology. J. Vis. Exp. (49), e2533, doi:10.3791/2533 (2011).

Todo el montaje hibridación in situ (WISH) es una técnica común en los laboratorios de biología molecular para estudiar la expresión génica mediante la localización de las transcripciones de ARNm específicos dentro de toda muestra de montaje. Esta técnica (adaptado de Albertson y Yelick, 2005) fue utilizado en un nivel superior de pregrado en el aula de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativa en la Universidad de Syracuse. Los dos primeros tercios del curso de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativo dio a los estudiantes la oportunidad de estudiar la embriología y anatomía de los organismos que representan a varios taxones diferentes cordados principalmente a través de disecciones tradicionales y el uso de modelos. La parte final del curso participan un enfoque innovador para la enseñanza de la anatomía a través de la observación del desarrollo de los vertebrados que emplean técnicas moleculares en la que desean se llevó a cabo en embriones de pez cebra. Un crecimiento de fibroblastos heterocigotos factor 8 un (fgf8a) mutante línea, as, se utilizó. Debido a la herencia mendeliana, as intercrosses tipo producido salvajes, heterocigotos y homocigotos mutantes ace/fgf8a en una proporción de 1:2:1. Sondas de ARN con patrones de expresión se conoce en la línea media y en el desarrollo de las estructuras anatómicas, como el corazón, somitas, tailbud, miotoma, y ​​el cerebro se utilizaron. WISH se realizó con el pez cebra en el 13 y somite etapas prim-6, con los estudiantes de realizar la reacción de tinción en la clase. El estudio de los embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo dio a los estudiantes la capacidad de observar cómo estas estructuras anatómicas cambiado en la ontogenia. Además, algunos mutantes ace/fgf8a muestra bucle corazón inadecuado, y defectos en los somitas y el desarrollo del cerebro. Los estudiantes en esta práctica observada el normal desarrollo de diversos sistemas de órganos con la anatomía externa, así como patrones de expresión génica. También se identifican y describen los embriones mostrando un desarrollo inadecuado anatómica y la expresión de genes (es decir, mutantes putativos).

Para los instructores de las instituciones que aún no poseen el equipo necesario o cuando los fondos para el laboratorio y la innovación curricular son limitados, el costo financiero de los reactivos y los aparatos puede ser un factor a considerar, así como el tiempo y el esfuerzo necesario por parte de la instructor independientemente de la configuración. Sin embargo, sostenemos que el uso de deseo en este tipo de salón de clases de laboratorio puede proporcionar un vínculo importante entre la genética del desarrollo y la anatomía. A medida que avanza la tecnología y la capacidad para estudiar el desarrollo de organismos en el nivel molecular se hace más fácil, más barato y cada vez más popular, muchos biólogos evolucionistas, los ecologistas, y los fisiólogos están recurriendo a estrategias de investigación en el campo de la biología molecular. WISH utilizando en una clase de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativo es un ejemplo de cómo las moléculas y la anatomía pueden converger en un solo curso. Esto le da a los estudiantes universitarios de nivel superior la oportunidad de practicar las técnicas modernas de investigación biológica, lo que lleva a una educación más diversificada y la promoción de la futura investigación científica interdisciplinaria.

1. Transformación del plásmido de cDNA de destino

Parte I: Transformación del plásmido

(Tiempo requerido: 3 horas más de incubación durante la noche)

1. Caliente el caldo SOC de nutrientes en un baño de agua 42 ° C (500 l por reacción)
2. Descongelar las células competentes en hielo
3. Añadir 1 l de plásmido a 25 células competentes l
4. Coloque sobre hielo durante 20 minutos
5. Las células de choque térmico de 42 ° C baño de agua durante 45 segundos
6. Coloque inmediatamente las células en hielo durante 2 minutos
7. Añadir 500 l de 42 ° C de caldo de nutrientes a cada vial de células
8. Agite a 37 ° C durante 2 horas a 255 revoluciones por minuto (rpm)
9. Placa 75 l de mezcla de transformación en placas de agar Luria Bertani (LB)
10. Incubar las placas invertidas a 37 ° C durante la noche

Parte II: E. coli Cultura

(Tiempo requerido: 15 minutos más una noche de incubación)

1. Para cada reacción, alícuota de 3 ml de caldo LB y 3 l de 50 mg / ml de ampicilina en un tubo de cultivo
2. Raspar una colonia de bacterias de la placa de agar y añadir a cada tubo de cultivo
3. Agitar los tubos de cultivo a 37 ° C a 255 rpm durante la noche

Parte III: Preparación plásmido

(Tiempo requerido: 1,5 horas)

1. Aislar el plásmido de cultivos de una noche con el primer Mini Kit de 5 FastPlasmid (Catálogo # 2300000)
2. Para comprobar la presencia de plásmidos preparados, ejecute el ADN eluido del kit en un gel de 1% Tris-acetato-EDTA (TAE) teñido con bromuro de etidio

2. In Situ marcada con DIG síntesis de ARN sonda

Parte I: Linealización del plásmido

(Tiempo requerido: 2.5 horas)

1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan:
   

   Preparado plásmido	20 ml
   * Restricción de enzimas	2 mL
   Buffer **	10 ml
   10 veces más albúmina de suero bovino (BSA)	10 ml
   Dietil pirocarbonato (DEPC) de agua	58 ml
   	100 ml

2. Se incuba a 37 ° C durante 2 horas
   * Varía con el plásmido
   ** Varía con la enzima de restricción

Parte II: Transcripción

(Tiempo requerido: 3 horas)

1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan:
   

   Lineal plásmido	4 ml
   Buffer 10X ** Transcripción	4 ml
   Digoxigenina Mix Etiqueta	4 ml
   Polimerasa	2 mL
   Inhibidor de la RNasa	2 mL
   DEPC agua	24 ml
   	40 ml

2. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora
3. Añadir 2 l * de la polimerasa
4. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora
5. Añadir 2 l de DNasa
6. Se incuba a 37 ° C durante 20 minutos
   * Varía con el plásmido
   ** Varía con la polimerasa

Parte III: Precipitación

(Tiempo requerido: 5 minutos más 2 horas de incubación durante la noche, una hora para centrifugar y resuspender)

1. Agregar 4 l de 0,2 M EDTA
2. Añadir 5 l de cloruro de litio 4M
3. Añadir 150 ml de hielo frío etanol al 100%
4. Se incuba a 80 ° C durante 2 horas a la noche a la mañana
5. Centrifugar a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, se decanta el sobrenadante de distancia
6. Seco en pelets durante 7 minutos
7. Vuelva a suspender en 20 l de agua DEPC
8. Se incuba a 37 ° C durante 5 minutos

Parte IV: Fraccionamiento - Realizar sólo si el tamaño de la sonda es mayor de 0,6 kb

(Tiempo requerido: Varía según el tamaño de la sonda, por lo general no más de 20 minutos)

1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan:
   

   Sonda de ARN	20 ml
   DEPC agua	12 ml
   Bicarbonato de Sodio	4 ml
   Carbonato de Sodio	4 ml
   	40 ml

2. Incubar en un baño de agua a 60 º C. La base del tiempo de incubación en la ecuación:
   Tiempo (min) = (a partir kb - deseado kb) / (0.11 x kb x partida deseado kb)
   Tamaño medio deseado = 0,6 kb

Parte V: La precipitación final

(Tiempo requerido: 5 minnutos más de 2 horas de incubación durante la noche, una hora para centrifugar y resuspender, 1 hora por electroforesis en gel)

1. Añadir 40 l de agua DEPC
2. Añadir 8 Acetato de Sodio l
3. Añadir 1,04 l de ácido acético glacial
4. Añadir 240 l de hielo frío etanol al 100%
5. Se incuba a 80 ° C durante 2 horas a la noche a la mañana
6. Centrifugar a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, se decanta el sobrenadante de distancia
7. Seco en pelets durante 7 minutos
8. Vuelva a suspender en 20 l de agua DEPC
9. Vortex para mezclar
10. Para comprobar la presencia de riboprobe, ejecutar la solución re-suspendido en un gel teñido 1% TAE con bromuro de etidio

3. Todo el montaje hibridación in situ

Parte I: La fijación de embriones y la digestión de proteinasa K

(Tiempo requerido: Fijar horas de la noche, más 4 al día siguiente para el almacenamiento, 2,5 horas de almacenamiento a la Parte II)

1. Recoger etapas embriones de pez cebra y fijar en 4% paraformaldehido (PFA) durante la noche a 4 ° C
2. Lavado de embriones fija en tampón fosfato salino que contiene 0,1% de Tween-20 (PBST) tres veces durante 10 minutos cada uno
3. Para garantizar que la exposición de los embriones a los reactivos experimentales, los embriones de forma manual dechorionate (si es necesario) con unas pinzas de punta fina
4. Deshidratar embriones por lavado en una serie gradual de 25% y 50% de metanol en PBST durante una hora cada lavado, a continuación, almacenar en el 100% de metanol a -20 ° C
5. Cuando esté listo para usar, rehidratar embriones en PBST por el lavado en un 50% (2 veces) y el 25% (1 vez) de metanol en PBST durante 10 minutos cada uno. Finalmente lavar dos veces durante 10 minutos cada uno en el 100% PBST. Fecha exacta no es importante para los lavados con PBST / metanol
6. Embriones cloro en una solución de peróxido de hidrógeno al 10% en PBST, si es necesario, para eliminar los pigmentos oscuros. Embriones se incuban en una solución de peróxido de hidrógeno durante 10-20 minutos, dependiendo de la edad del embrión, y la tapa del tubo de microcentrífuga deben permanecer abiertas para evitar la acumulación de presión de aire
7. Embriones digerir con 50 mg / ml de proteinasa K diluido 1:5000 en PBST durante 3-15 minutos, dependiendo de la edad del embrión
8. Fijar de nuevo los embriones en el 4% PFA durante 30 minutos y luego lavar 3 veces en PBST durante 5 minutos cada uno

Parte II: La hibridación de ribosondas

(Tiempo requerido: 3 horas y durante la noche para la hibridación, 1,5 horas del día siguiente a la Parte III)

9. Prehybridize embriones con solución de prehibridación (PHS) en un horno precalentado a 70 ° C baño de agua durante 2-3 horas
10. Quitar PHS, se añaden 0,5 ml solución de hibridación y 1,5 l previamente sintetizadas riboprobes digoxigenina etiquetados, se incuba a 70 ° C durante la noche. La temperatura puede variar dentro de unos pocos grados en función del objetivo riboprobe
11. Al día siguiente, lave los embriones a 70 ° C en soluciones graduales de 75%, 50% y el 25% de PHS de citrato de sodio 2 veces con solución salina (SSC) de 10 minutos cada uno, luego se lava en 0,2 X SSC durante 30 minutos a 68 ° C
12. Lave en tampón de ácido maleico (MAB) 2 veces durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente

Parte III: anti-digoxigenina (α-DIG) incubación del anticuerpo

(Tiempo requerido: 3 horas y durante la noche para bloquear, 2,5 horas del día siguiente a la Parte IV)

13. La transferencia de embriones en una placa de 12 pocillos
14. Bloque de pre-embriones en una solución de 2.1 ml de bloqueo por lo menos 3 horas a temperatura ambiente
15. Al mismo tiempo, antes de bloquear los anticuerpos mediante la preparación de un segundo volumen de la solución de bloqueo y la dilución 1:2000 del anticuerpo anti-digoxigenina en esta solución
16. Eliminar pre-y agrega 1-2 ml pre-bloqueado α-DIG solución, incubar durante la noche a 4 ° C
17. Al día siguiente, lave los embriones en el MAB. Permitir que los embriones se incuban en el MAB durante 5 minutos, luego realizar los cambios de tampón y se incuba durante dos de 10 minutos, un minuto 30 y un intervalo de 60 minutos. Fecha exacta no es necesario
18. Lavado de embriones 3 veces durante 5 minutos en cada una de fosfatasa alcalina (AP) tampón

Parte IV: La tinción y el procesamiento final

(Tiempo requerido: 1 hora o toda la noche para la tinción, dependiendo de la riboprobe utilizados, 4 horas a partir de lavados de glicerol, 06.10 horas por lavado de glicerol, puede ser almacenado en glicerol)

19. Agregar 1.2 ml de solución colorante a los embriones, envolver en papel de la placa y comprobar manchas a intervalos regulares (cada 20 minutos) hasta que la tinción es suficiente
20. Lavado de embriones con PBST dos veces durante 5 minutos cada uno para detener la reacción de tinción
21. Deshidratar embriones con 10 minutos se lava en el 25% (1 vez) y el 50% (2 veces) de metanol en PBST, luego en el 100% de metanol, para eliminar manchas de fondo
22. Permita que los embriones se incuban en metanol al 100% por lo menos 2 horas a temperatura ambiente
23. Rehidratar en PBST con 10 minutos se lava en el 50% (2 veces) y el 25% (1 vez) de metanol en PBST, luego lave en el 100% PBST 2 veces
24. Transferencia e manchadombryos a una solución de glicerol al 80% en PBST, utilizando una serie gradual de lava, y se almacenan a 4 ° C.

Recetas:

• Placas de agar LB-10 g de agar LB + 250 ml de agua destilada, autoclave, cuando están frías al tacto añadir 250 l de ampicilina, vierta solución caliente 15-20 ml en cada placa de Petri, permiten agar para solidificar
• Caldo de LB-12.5 g de caldo de LB + 200 ml de agua destilada, autoclave, deje que se enfríe antes de su uso
• 1% TAE gel de agarosa 0,4 g, 40 ml de 1X TAE, 2 l de bromuro de etidio; carga de 7 l plásmido (plásmido de transformación de la meta de ADNc) o 3 y 4 riboprobe l l de agua DEPC (In situ Síntesis marcada con DIG sonda de ARN) + un colorante de carga l, 5 l escalera del ADN
• Prehibridación solución-formamida al 50%, 5X SSC, 9,2 mm ácido cítrico, el 1% de Tween-20
• Hibridación solución de prehibridación solución más 500 mg / ml tRNA y 50 ug / ml de heparina
• MAB-100mm ácido maleico, 150 mM NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, el pH a 7.5
• Solución de bloqueo-3 partes del MAB, una parte del 10% reactivo Boehringer bloqueo en el MAB, un calor parte desactivado cordero suero
• AP-buffer 60 mM Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl _2, 0,1% Tween-20
• Solución-5-Bromo-4-cloro-3-indolil tinción fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) en tampón AP

4. Los resultados representativos

Cuando se realiza correctamente, la reacción entre el NBT, BCIP y fosfatasa alcalina se forma un precipitado violeta que deben aparecer en el embrión del pez cebra como una mancha púrpura. Riboprobes debe ser previamente sintetizada a partir de cDNA correspondiente al gen de interés. Por lo tanto, se puede concluir cualquier mancha visualizada representa las áreas del pez cebra en el que ha sido el gen de interés transcribir en esta etapa de desarrollo en particular. A los efectos de este curso, riboprobes se sintetizaron a partir aldh1a2 (antes RALDH2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates y otros, 2005.) MyoD1 (Weinberg et al, 1996.) shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) y myl7 (antes cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. La tinción se espera en la línea media y en las estructuras anatómicas como las somitas, tailbud, miotoma, el cerebro y el corazón. Mutantes Ace/fgf8a se espera que tengan defectos de muchas de estas estructuras. La tinción se visualiza fácilmente usando un microscopio de disección estándar. Fuentes adicionales contienen más información y resolución de problemas en el deseo de técnicas similares a las descritas aquí (Clark, 2003;. D'Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009).

Figura 1. Un embrión de pez cebra 24 horas después de la fecundación, que se ha hibridado con riboprobes específicas para aldh1a2. Tinción específica se puede ver en los ojos, la parte posterior del cerebro, aleta pectoral brote primordios, y somitas. Anterior es la parte superior, posterior está en el fondo.

Figura 2. Un embrión de pez cebra en la etapa 13 somite de desarrollo que se ha hibridado con una sonda específica para fgf8a. Tinción específica se ve en el telencéfalo, diencéfalo dorsal, la cobertura del cerebro medio-hindbrain, somitas, y tailbud. Ventral está a la izquierda, dorsal está a la derecha.

Figura 3. A 22 horas después de la fecundación de embriones de pez cebra que se ha hibridado con una específica para riboprobe pax2a, un marcador robusto útil para visualizar el sistema nervioso. Tinción específica se puede ver en la cisura coroidea, la cobertura del cerebro medio-hindbrain, vesícula ótica, y las neuronas de médula espinal. Vista dorsal con el anterior a la izquierda.

Deseo fue utilizado en un curso de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativa para ayudar a los estudiantes a entender el papel de la genética en el desarrollo anatómico a través de la visualización de patrones de expresión génica conocida. Para la primera parte del curso, los estudiantes realizaron disecciones en los organismos que representan a varios taxones cordados diferentes, lo que les permite suficiente tiempo para estudiar, comprender, comparar, y la anatomía de vertebrados contraste.

Como introducción a la segunda parte del curso, los estudiantes se les dio una conferencia formal que describe el desarrollo del pez cebra y la anatomía. Los métodos y los resultados previstos del experimento DESEA también fueron discutidos. Los estudiantes se les dio el pez cebra vive en somitogenesis y prim-6 etapas de desarrollo, ya las 2 y 5 días después de la fertilización (dpf) para examinarla bajo el microscopio de disección. Esto fue a dar a los estudiantes una mejor comprensión de lo que parece embriones de pez cebra y los tipos de cambios morfológicos que ocurren durante la ontogenia.

En la sesión de laboratorio siguiente, los estudiantes recibieron embriones de pez cebra en el que deseo se había realizado previamente. Se les pidió que estudiar y describir los patrones de expresión genética para cada gen de interés (riboprobe utilizado). Embriones utilizados para WISH se derivan de las uniones entre miembros de una línea de ace/fgf8a heterocigotos. Sobre la base de la herencia mendeliana, el 25% de los embriones de los apareamientos ace/fgf8a se espera que sea homocigotos mutantes y exhibir los defectos de muchas de las estructuras anatómicas se centró en este curso. Basándose en los informes publicados y observaciones no publicadas en el laboratorio de Albertson, defectos en el cerebro y el corazón de bucle incorrecto se esperaba, así como defectos en las somitas (Brand et al, 1996;. Albertson y Yelick, 2005; observaciones personales).

Los estudiantes se les pidió que examinar todas las muestras, de tipo salvaje (animales heterocigotos se distinguen de sus hermanos de tipo salvaje en las primeras etapas de desarrollo) y homocigotos mutantes, para cada patrón de expresión génica presentados. Luego se les pidió a escribir informes de laboratorio que describe sus resultados, y en base a sus conocimientos de anatomía y genética, ¿cómo la expresión del gen defectuoso puede haber precipitado malformaciones anatómicas.

Los estudiantes parecían recibir este ejercicio de laboratorio con el entusiasmo y la curiosidad. La mayoría nunca habían utilizado deseo antes y estaban muy interesados ​​en esta parte del curso. Estudiantes que se encuentren los diferentes patrones de expresión genética en los embriones de pez cebra intrigante, algunos incluso se describen los patrones de tinción visualizarse mediante la asociación con conocidos diseños y símbolos, como una cara sonriente. Los informes de laboratorio resultantes mostraron que los estudiantes tenían un conocimiento general del protocolo de deseo y la expresión de genes en estructuras anatómicas específicas. Los estudiantes también fueron requeridos para entender las funciones específicas de los genes estudiados utilizando desee durante el tiempo de laboratorio (Stickney y otros, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Gita-Loganathan et al, 2008a;.. Gita-Loganathan et al, 2008b ). Era evidente sin embargo, que algunos estudiantes tenían un conocimiento limitado de fondo de las vías de señalización y los genes de interés. Más información acerca de estos conceptos en el deseo de charla introductoria puede ser una adición bienvenida a la utilización de deseo en el futuro cursos de Biología Comparada de Vertebrados.

Dado que el protocolo generalmente toma cuatro días consecutivos, dependiendo del horario del curso, los alumnos sólo pueden ser capaces de completar una parte del experimento en la clase y el profesor debe ser responsable por el resto. En nuestra clase de Biología de Vertebrados comparativo, los alumnos de las reacciones de tinción en el laboratorio, mientras que el Asistente de Enseñanza realizado todos los pasos anteriores. Si se prefiere que los estudiantes realizan WISH en clase, el protocolo puede ser dividida en sub-unidades que se pueden realizar en varias sesiones de laboratorio, en función del tiempo de la clase. Si no es factible para los estudiantes para llevar a cabo todo el protocolo, ya que fue aquí, debido a la reunión de laboratorio una vez por semana, los estudiantes pueden agregar la solución de tinción en el comienzo de la clase y, en función de la riboprobe utilizados, tienen la coloración completa dentro de una hora. El tiempo necesario para que la mancha de desarrollar varía mucho con cada riboprobe y una variedad de condiciones experimentales, y debe ser determinado antes de la clase. Cabe destacar que, si los alumnos sólo será el desarrollo de la mancha en el laboratorio, los instructores serán responsables de todos los pasos anteriores, lo que requerirá mucho tiempo y esfuerzo fuera de las aulas. Si lo desea, una alternativa más corta que deseen podrían ser inmunohistoquímica, con las etiquetas de anticuerpos para visualizar la localización de proteínas, sin embargo en este momento, el pez cebra anticuerpos específicos para los genes de desarrollo no están disponibles. Otra opción sería realizar deseo en diferentes especies de vertebrados unº que los estudiantes comparar los patrones de expresión de los mismos genes en diferentes organismos (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. emergentes organismos modelo, de 2008; emergentes organismos modelo, 2010).

El objetivo general del uso de deseo en un curso de Biología de Vertebrados comparativo era demostrar a los estudiantes como técnicas de biología molecular se utilizan para estudiar el desarrollo anatómico. Es también una oportunidad para que los estudiantes especular acerca de cómo modificar la expresión de genes puede conducir no sólo a malformaciones en el desarrollo, sino también para el cambio evolutivo. Formalizada como la biología evolutiva del desarrollo (a menudo denominado como "evo-devo"), este campo de rápido crecimiento de estudio tiene como objetivo vincular el genotipo y el fenotipo a través del desarrollo, y para dilucidar las bases potenciales mecánica del cambio evolutivo. Con el auge de este campo, más ecólogos, biólogos de organismos, y los fisiólogos están empleando técnicas moleculares en sus investigaciones. Nosotros sostenemos que el uso del deseo en un curso de Vertebrados Biología comparativa le ayudará a mantener el plan de estudios al día con los avances tecnológicos actuales y conceptuales en la investigación, y para facilitar un mejor alineamiento horizontal de los cursos de nivel superior mediante la combinación de la biología subcampos biológica. Por otra parte, este enfoque integrador proporcionará a los estudiantes la oportunidad de aprender una variedad de técnicas de investigación biológica en un curso, lo que lleva a una educación más diversificada y la promoción de la futura investigación científica interdisciplinaria.

No hay conflictos de interés declarado.

Los autores desean agradecer al Departamento de Biología de la Universidad de Syracuse y la Dra. Marilyn Kerr por su papel en la administración del curso de Vertebrados Biología comparativa. El laboratorio de Albertson es financiado por el subsidio R21DE019223 de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial, así como otorgar R01AG031922 de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Envejecimiento.

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