طريقة بسيطة لقياس حساسية الايثانول في الذباب

Maples, T., Rothenfluh, A. A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies. J. Vis. Exp. (48), e2541, doi:10.3791/2541 (2011).

الجرعات المنخفضة من الذباب تسبب الايثانول ليصبح مفرط ، في حين جرعات عالية من المسكنة. ويرتبط حساسية الإيثانول الناجم عن التخدير من سلالة يطير مع إعطاء أفضلية الايثانول أن سلالة ثانية ، وبالتالي التخدير هو مقياس ذات أهمية كبيرة لدراسة علم الوراثة من الاستجابات الكحول والشرب. نحن يبرهن على وجود طريقة بسيطة للكشف عن الذباب لالإيثانول وقياس آثاره المسكرة. يمكن للمقايسة وصفنا تحديد الحساسية الحادة ، فضلا عن التسامح الإيثانول الناجم عن التعرض للتكرار. أنها لا تتطلب إعداد تشارك من الناحية الفنية ، وبالتالي يمكن تطبيقه في أي مختبر مع الأدوات الأساسية لثقافة الطيران.

1. إنشاء غرفة التعرض

1. قطع المكونات فيال في نصف باستخدام شفرة حلاقة. بدلا من ذلك ، استخدام كرات القطن.
2. دفع نصف قنينة المكونات ، أو القطن الكرة ، والجزء السفلي من قنينة الغذائية لجعل سطح أملس التي لن تتعثر فيها الذباب
3. إذا جعل التعرض غرف متعددة ، تأكد من أن المكونات الغذائية القارورة ويستغرق نفس الحجم في كل من المجلسين. ويمكن لعلامة على جانب القنينة تسهيل ذلك.

2. تعريض الذباب

1. 8 جمع الذباب من جنس واحد ، والعمر 1-5 أيام ، في اليوم قبل التعرض الى قارورة الغذائية العادية دون الخميرة.
2. التسمية عليها في القانون ، بحيث يتم أعمى المجرب إلى التركيب الوراثي الفعلي / السلالة المستخدمة.
3. نقل الذباب الثمانية في الدوائر التي تعرض تنصت. لا تخدير.
4. إضافة كمية صغيرة من صبغة الطعام ، مثل حمض الأزرق 9 ، إلى إيثانول برهان 200 لجعله مرئيا بسهولة.
5. معطف قاع القارورة المكونات ، أو القطن الكرة ، مع الايثانول مل 0.5.
6. تضاف المكونات الإيثانول في قنينة التعرض. تأكد من أن يواجه الكحول في القارورة ، وليس تجاه جدار القارورة.
7. بدء العد حتى الموقت.

3. سجل الإيثانول التي يسببها التسمم

1. وبدأت كل دقيقة بعد الموقت ، الاستفادة من غرفة التعرض على مقاعد البدلاء لجفل الذباب ومراعاة منها لمدة عشر ثوان.
2. تسجيل عدد من الذباب ثابتة لكل دقيقة. الذباب هي ثابتة اذا لم يتمكنوا من النزول ظهورهم ، البقاء في مكان واحد ، أو يهتز بسرعة أجنحتها طوال كامل الفترة الثانية عشرة للمراقبة. تعتبر ذبابة الأخير ثابتة ، لأن الغالبية العظمى من هؤلاء الذباب هي ثابتة بين فترات من حركة الجناح السريع. الذباب ليس ثابتا اذا كان بامكانهم النزول ظهورهم والابتعاد و / أو حتى جدار القارورة.
3. انتهاء محاكمة التعرض عندما يتم تسجيل 4 أو أكثر من الذباب وثابتة.
4. تجاهل الذباب ، والسماح للهواء الغرفة من التعرض لإعادة استخدامها في وقت لاحق.

4. تحديد الوقت المناسب لتهدئة 50 ٪

الوقت لتخدير 50 ​​٪ (ST50) هو وقت بعد بدء التعرض الايثانول عند أربعة من الذباب ولا تزال هناك ثمانية ثابتة. يتم تحديد هذه على النحو التالي :
إما : القياس الدقيقة الاولى عندما تماما أربعة الذباب هي ثابتة.
أو : إذا كان أقل من أربعة الذباب (Y1) هي ثابتة عند نقطة زمنية واحدة (X دقيقة) ، وأكثر من أربعة (Y2) في نقطة القياس في المرة القادمة (الدقيقة X +1) ، ثم دس في ST50 خطيا باستخدام الصيغة :
ST50 = (4 -- Y1) / (Y2 -- Y1) + X

5. تكرار التعرض لتحديد التسامح

تعريض الذباب

1. تحديد ST50 (بالوزن) للسيطرة سلالة من النوع البري المستخدمة في تجربتك.
2. كشف المجموعات التجريبية من الذباب إلى إيثانول على النحو المبين أعلاه.
3. قياس ST50 بهم (1) ، لكنها ما زالت تعرض حتى تصل في الوقت 2X ST50 (بالوزن).
4. نقل الذباب العودة الى قارورة فارغة الغذائية ، وعقد لمدة 4 ساعات.
5. إعادة فضح الذباب ، وتحديد ST50 (2) من التعرض 2.

تحديد التسامح

التسامح في حساب ٪ ك (ST50 (2) / ST50 (1) -- 1) X100.

6. ممثل النتائج :

هو موضح هنا ، هي بعض النتائج التي حصلنا عليها مع ممثل 6-8 قارورة من الذباب في التركيب الوراثي والجرعة. إذا كان الخطأ هو معيار الخاص أكبر بكثير ، ثم حدثت مشكلة منهجية احتمالا. تأكد من أن يواجه الايثانول في غرف التعرض ، وبأن الدوائر هي نفس الحجم.

الذباب يتعرض الاستجابة للجرعة الرقم 1. منحنى نوع البرية لنسب متزايدة من الايثانول. تعرضت ثماني قنينات من الذباب في جرعة والجنس. الذباب الذكور والإناث تظهر ST50 نفسه في كل جرعة (P> 0.22 ، 2 - طريقة ANOVA) ، بينما عبر جرعات ST50 يقلل بشكل ملحوظ مع زيادة الجرعة الإيثانول (P <0.001). يمكن أن نلاحظ أن أكثر من الذباب المزدحمة زجاجات يكون أصغر بكثير من تلك الزجاجات من الأصحاء ، وهذا الاختلاف يمكن أن تؤثر على حجم ST50. البذور كل زجاجة مع الإناث 15-20 زرع لمدة 1-2 أيام للحصول على كثافة اليرقات الأمثل للزجاجة الواحدة.

الشكل 2. تعريض الذباب إما الايثانول 90 ٪ ، أو 100 ٪ يستنسخ الموصوفة سابقا الايثانول المقاومة التي يسببها الأبيض rabbit1 (ANOVA ع <0.001 ، 2 - الطريقة) mutation2.

الشكل 3. كرر التعرض لالإيثانول بنسبة 100 ٪ ، متباعدة عن طريق الانتعاش فاصل 4 ساعات ، يؤدي إلى زيادة كبيرة في ST50 بعد التعرض الثاني (P <0.001 ، ر الاقترانللتجارب). علما أن تعرضت لمدة 24 دقيقة الذباب خلال أول تعرض (الموافق لقد مرتين على ST50 غ). ولم تعرض لأقصر فترة من الوقت (12 دقيقة) لا تسبب زيادة كبيرة في ST50 عند التعرض إعادة (لا تظهر البيانات).

في هذا العرض ، وقد أوجزنا طريقة بسيطة لتحديد الإيثانول التي يسببها التسمم بناء على فحوصات السابقة التي وصفها Bainton آخرون. 2000 ¹ ، وRothenfluh آخرون. 2006 ^2. منذ يرتبط الكحول بفعل التخدير مع تفضيل شرب الكحول ³ ، هذا الاختبار هو ذات الصلة لدراسة الاضطرابات الناجمة عن تعاطي الكحول. ويستند في وصفها على مقايسة باغت السلبية الناجمة عن انجذاب بالجاذبية ، وكيف أن التعرض للكحول يتداخل مع هذه الاستجابة الفطرية. قبل البدء في التعرض للتأكد من كل ما تبذلونه من الذباب تظهر استجابة طبيعية لجفل من هذا القبيل ، أي بعد التنصت باستمرار على الذباب في قارورة الغذاء ، فإنها ينبغي أن يتحرك كل من القاع في غضون فترة زمنية 10 الملاحظة الثانية. أمثلة من الذباب وجود انجذاب بالجاذبية السلبية تشمل خفض المسوخ الاستيلاء الانفجار حساسة ⁵ ، والتي تعاني من نقص تنقل الذباب الناجم عن تنكس الخلايا العصبية الدوبامين ^6.

على الرغم من أن الفحص وصف بسيط نسبيا ، المتغيرين تستحق أكبر قدر من الاهتمام لضمان تحقيق نتائج يمكن استنساخه. أولا ، يجب أن تكون كل قارورة من التعرض لنفس الحجم. وهذا يشمل التأكد من أن الجزء السفلي من قنينة تحتوي على نفس الحجم من المواد الغذائية الكرة فيال المكونات / القطن + ، فضلا عن إدراج المكونات التي تحتوي على الإيثانول على مسافة واحدة مقابل كل قنينة. ويمكن استخدام قارورة فارغة تماما لهذا الاختبار ، لكنه يؤدي إلى قيم ST50 أطول ، وانخفاض الإنتاجية للمقايسة.

هذا الاختبار هو أيضا مناسبة لتحديد كمية من الذباب التسامح عند التعرض تطوير الإيثانول تكرار. وينبغي النظر في عدد من المتغيرات عند القيام التعرض للتكرار. الأول ، هو موضح هنا الفاصل الزمني بين التعرض إلى 4 ساعات. يمكن تغيير هذا المتغير ، ولكن من المستحسن ألا يكون أقل من 2 ساعة ، لضمان إزالة الألغام من الايثانول من التعرض الأولى. انظر شولتس وآخرون. 2000 ⁴ لحركية التنمية التسامح الإيثانول والاضمحلال. المتغير الثاني هو أن تنظر إلى مدة التعرض الأولى. هذا ومن الواضح أن تكون هي نفسها لمراقبة والذباب التجريبية. ولكن هذا قد لا يؤدي في نفس المقدار من الايثانول تسليمها الى كل من هذه السلالات يطير. الذباب مخدرا استيعاب المزيد من الايثانول من الذباب النشط ² ، لذا فإن السلالة التي sedates في وقت سابق قد تتلقى جرعة أعلى من سلالة المسكنة في وقت لاحق ، وبالتالي وضع مزيد من التسامح بسبب جرعة أولية أعلى. اننا نحذر بشدة القارئ عند مقارنة تطور سلالات من التسامح التي تظهر الاختلافات في ST50 الأولي (1).

في مقايسة وصفنا هنا هو أداة مفيدة في تحديد بسهولة وبتكاثر الذباب الاستجابات السلوكية للكحول.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نشكر Aylin رودان لقراءة نقدية للمخطوطة ، وأعضاء في مختبر للمناقشة مفيدة. ويدعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، R01AA019526.

1. R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai, C. S. Singh, M. S. Moore et al., Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
2. A. Rothenfluh, R. J. Threlkeld, R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai et al., Cell 127, 199-211 (2006).
3. A. V. Devineni and U. Heberlein. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
4. H. Scholz, J. Ramond, C. S. Singh, and U. Heberlein. Neuron 28, 261-271 (2000).
5. M. J. Allen, T. A. Godenschwege, M. A. Tanouye, and P. Phelan. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
6. M. B. Feany, and W. W. Bender. Nature 404, 394-398 (2000).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.