דרך פשוטה למדוד את רגישות אתנול זבובים

Maples, T., Rothenfluh, A. A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies. J. Vis. Exp. (48), e2541, doi:10.3791/2541 (2011).

מינון נמוך של אתנול לגרום זבובים להיות היפראקטיבי, ואילו במינונים גבוהים הם מרגיעים. רגישות כדי הרגעה אתנול-Induced של זן זבוב נתון בקורלציה עם העדפה אתנול כי זה זן, ולכן הרגעה הוא מדד רלוונטי ביותר ללמוד את הגנטיקה של התגובות אלכוהול ושתייה. אנו מדגימים דרך פשוטה לחשוף טס אתנול למדוד תופעות המשכר שלו. Assay אנו מתארים יכול לקבוע רגישות חריפה, כמו גם סובלנות אתנול הנגרם על ידי חשיפה חוזרת. היא לא דורשת התקנה מעורב מבחינה טכנית, ולכן יכול להיות מיושם במעבדה עם כל הכלים הבסיסיים תרבות לעוף.

1. יצירת תא חשיפה

1. גזור בקבוקון תוסף במחצית באמצעות סכין גילוח. לחלופין, להשתמש כדורי צמר גפן.
2. דחוף את התקע בקבוקון וחצי, או כדור צמר גפן, אל החלק התחתון של בקבוקון אוכל לעשות משטח חלק, כי זבובים לא להיתקע בו
3. אם עושים לתאי חשיפה מרובות, לוודא כי התקע בקבוקון ומזון תופסים נפח זהה בתא אחד. סימן בצד של הבקבוקון יכולים להקל על זה.

2. חשיפת זבובים

1. איסוף 8 זבובים אחד מין, גיל 1-5 ימים, יום לפני החשיפה לתוך צלוחיות מזון רגיל בלי שמרים.
2. תווית אותם בקוד, כך הניסוי הוא עיוור כדי גנוטיפ את המתח בפועל / השתמשו.
3. העברת שמונה זבובים לתאי חשיפה ידי הקשה. לא להרדים.
4. הוספת כמויות קטנות של מזון צבע, חומצה למשל כחול 9, אתנול 200 הוכחה כדי להפוך אותו לגלוי בקלות.
5. מעיל התחתון של פקק הבקבוקון, או כדור צמר גפן, עם אתנול 0.5 מ"ל.
6. הכנס את התקע אתנול לתוך בקבוקון את החשיפה. ודא כי אלכוהול הוא פונה לתוך הבקבוקון, ולא לכיוון הקיר של הבקבוקון.
7. התחל טיימר ספירה למעלה.

3. אתנול-Induced שיא שכרות

1. כל דקה לאחר טיימר מופעל, לחץ על תא החשיפה על הספסל, כדי להפתיע את הזבובים לצפות בהם במשך עשר שניות.
2. רשום את מספר הזבובים נייח לרגע אחד. זבובים הם נייח אם הם לא יכולים לרדת גבם, להישאר במקום אחד, או לרטוט במהירות כנפיהם לאורך התקופה כולה תצפית עשר שניות. הזבובים האחרונים נחשבים נייח כי הרוב המכריע של זבובים אלה נייחים בין תקופות של אגף התנועה המהירה. זבובים הם לא נייח אם הם יכולים לקבל את גבם וללכת ו / או את הקיר בקבוקון.
3. משפט החשיפה הוא סיים כאשר 4 או יותר זבובים נרשמות נייח.
4. בטל זבובים והניח לאוויר החדר חשיפה החוצה לשימוש במועד מאוחר יותר.

4. קבע את זמן הרגעה 50%

זמן הרגעה 50% (ST50) היא זמן לאחר תחילת החשיפה אתנול כאשר ארבעה מתוך שמונת זבובים להישאר נייח. זה נקבע כדלקמן:
או: ברגע המדידה הראשונה כאשר בדיוק ארבעה זבובים הם נייחים.
או: אם פחות מארבע זבובים (Y1) הם נייח בנקודה פעם אחת (X דקה), ויותר מארבעה (Y2) בנקודת המדידה בפעם הבאה (X 1 דקה), ואז באופן ליניארי אינטרפולציה ST50 באמצעות הנוסחה:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X

5. חזור על חשיפה לקבוע סובלנות

חשיפת זבובים

1. קבע את ST50 (wt) עבור זן wild-type הבקרה השתמשו בניסוי.
2. לחשוף את קבוצות הניסוי של זבובים אתנול כמתואר לעיל.
3. מדוד ST50 שלהם (1), אבל ממשיכים לחשוף עד שתגיע השעה 2x ST50 (wt).
4. העברת הזבובים בחזרה לתוך בקבוקון שימורים ריקה, והחזק במשך 4 שעות.
5. Re-לחשוף את זבובים, ולקבוע את ST50 (2) החשיפה 2.

קבע סובלנות

חישוב סובלנות% כמו (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100.

6. נציג תוצאות:

מוצג כאן, כמה תוצאות נציג השגנו עם 6-8 בקבוקונים של זבובים לכל גנוטיפ ואת המינון. אם השגיאה הרגיל שלך הוא גדול יותר באופן משמעותי, אז בעיה שיטתית התרחשה סביר. ודא כי אתנול פניהם לתאי חשיפה, וזה התאים הם באותו נפח.

באיור 1. בתגובה עקומת מנה של סוג בר זבובים שנחשפו אחוזי הגוברת של אתנול. שמונה צלוחיות של זבובים שנחשפו למנה ומין. זבובים זכר ונקבה להראות ST50 באותו מינון כל (p> 0.22, 2-way ANOVA), בעוד ST50 ברחבי מינונים פוחתת משמעותית עם הגדלת המינון אתנול (p <0.001). שים לב זבובים מעל צפוף בקבוקים ניתן באופן משמעותי יותר מאשר אלה מבקבוקי בריא, וזה ההבדל גודל יכולים להשפיע על ST50. כל בקבוק Seed עם נקבות 15-20 הנחת 1-2 ימים להשיג צפיפות מיטבית הזחל לבקבוק.

איור 2. חשיפת טס אתנול 90%, או 100% או משחזרת את שתואר לעיל אתנול התנגדות הנגרמת על ידי הלבן rabbit1 mutation2 (p <0.001, 2-way ANOVA).

איור 3. חזור על חשיפה של 100% אתנול, במרווחים על ידי מרווח התאוששות 4 שעה, גורמת לעלייה משמעותית ST50 לאחר החשיפה השניה (p <0.001, לא מזווגמבחן). שים לב הזבובים נחשפו במשך 24 דקות במהלך החשיפה הראשונה (המקביל ל ve פעמיים שלהם na ST50). חשיפה לכמות זמן קצר יותר (12 דקות) לא גרמה לעלייה משמעותית ST50 בחשיפה מחדש (מידע לא מוצג).

במצגת זו, גיבשנו דרך פשוטה לקבוע אתנול-Induced שכרות בהתבסס על מבחני הקודם שתואר על ידי Bainton et al. 2000 ^1, Rothenfluh et al. 2006 ^2. מאז אלכוהול-Induced הרגעה היא בקורלציה עם העדפה שתיית אלכוהול ^3, assay זה רלוונטי לחקר הפרעות שימוש באלכוהול. Assay המתואר מבוסס על בהלה הנגרמת geotaxis שלילי, ואיך חשיפה אלכוהול מפריע תגובה זו מולדת. לפני תחילת החשיפה, לוודא שכל זבובים שלך להראות תגובה נורמלית כדי לא להבהיל כזה, כלומר לאחר הקשה את זבובים הבקבוקון מזון, הם צריכים את כל המהלך מלמטה תוך זמן 10 תצפית השני. דוגמאות של זבובים לאחר geotaxis שלילית מופחתת כוללים המפץ רגיש מוטנטים תפיסת ^5, תנועה מחסר זבובים נגרמת על ידי התנוונות של נוירונים דופמין ^6.

למרות assay תיאר היא פשוטה יחסית, משתנים two בזכות תשומת הלב הרבה ביותר כדי להבטיח תוצאות לשחזור. ראשית, כל צלוחיות החשיפה צריך להיות באותו נפח. זה כולל לוודא את החלק התחתון של הבקבוק מכיל באותו נפח של כדור + בקבוקון תוסף / כותנה מזון, כמו גם להכניס את התקע אתנול המכילים את אותו המרחק עבור כל בקבוקון. בקבוקון ריק לחלוטין יכול לשמש assay זה, אבל זה מוביל ערכים ST50 יותר, להקטין את התפוקה של assay.

Assay זה מתאים גם כדי לקבוע את כמות הזבובים סובלנות לפתח אתנול בחשיפה חוזרת. מספר משתנים יש לשקול כאשר עושים חשיפות חוזרות. ראשית, המרווח בין החשיפה מתוארת כאן 4 שעות. משתנה זה יכול להיות שונה, אבל אנחנו ממליצים לא להיות נמוך מ 2 שעות, כדי להבטיח פינוי של אתנול מחשיפה הראשונה. ראה שולץ et al. 2000 ⁴ עבור קינטיקה של פיתוח סובלנות אתנול וריקבון. המשתנה השני הוא לשקול את משך החשיפה הראשונה. זה כמובן חייב להיות זהה עבור השליטה והזבובים ניסיוני. עם זאת, זה לא עלול לגרום את אותה כמות האתנול נמסר הן אלו זנים לעוף. זבובים מסומם לספוג אתנול יותר זבובים פעיל ^2, ולכן זן זה sedates מוקדם עלול לקבל מינון גבוה יותר מאשר זן מאוחר יותר, מרגיעים, וכך לפתח עמידות יותר עקב מינון ראשוני גבוה יותר. אנחנו מאוד בזהירות את הקורא כאשר משווים פיתוח סובלנות של זנים המראים הבדלים ST50 הראשוני (1).

Assay אנו מתארים כאן הוא כלי שימושי בקלות reproducibly בקביעת זבובים תגובות התנהגותיות לאלכוהול.

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מודים Aylin רודן לקריאה ביקורתית של כתב היד, ואנשי המעבדה לדיון מועיל. מחקר זה נתמך על ידי NIH, R01AA019526.

1. R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai, C. S. Singh, M. S. Moore et al., Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
2. A. Rothenfluh, R. J. Threlkeld, R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai et al., Cell 127, 199-211 (2006).
3. A. V. Devineni and U. Heberlein. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
4. H. Scholz, J. Ramond, C. S. Singh, and U. Heberlein. Neuron 28, 261-271 (2000).
5. M. J. Allen, T. A. Godenschwege, M. A. Tanouye, and P. Phelan. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
6. M. B. Feany, and W. W. Bender. Nature 404, 394-398 (2000).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.