파리에서 에탄올 민감도를 측정하는 간단한 방법

Maples, T., Rothenfluh, A. A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies. J. Vis. Exp. (48), e2541, doi:10.3791/2541 (2011).

에탄올 원인의 낮은 복용량이 높은 양이 sedating있는 동안, hyperactive 될 날아. 주어진 플라이 변형의 에탄올 유발 진정 작용에 감도는 그 변형의 에탄올 환경과 상호, 따라서 진정 작용은 알코올 반응과 음주의 유전을 연구하기 위해 관련성이 조치입니다. 우리는 환상적 효과를 에탄올과 측정 파리 노출하는 간단한 방법을 보여줍니다. 우리가 설명하는 분석은 반복 노출에 의해 유도된 급성 감도뿐만 아니라 에탄올 내성을 확인할 수 있습니다. 그것은 기술적으로 관련된 설정을 필요하지 않습니다, 따라서 기본적인 비행 문화 도구로 어떤 실험에 적용할 수 있습니다.

1. 노출 챔버 만들기

1. 면도날을 사용하여 반으로 병을 플러그 컷. 또는, 면화 공을 사용합니다.
2. 파리가 인치 끼지는 것이다 부드러운 표면을 만들어 식품 약병의 하단에, 유리병 플러그 절반 또는 목화 공을 밀어
3. 다중 노출 챔버 스를 만드는 경우, 유리병 플러그 식품 각 챔버에서 동일한 볼륨을 받아 있는지 확인하십시오. 유리병의 측면에 마크는 이것을 용이하게하실 수 있습니다.

2. 파리를 노출

1. 하나의 성별, 나이 1~5일, 누룩을 넣지 않은 일반 식품 유리병에 노출 전날 8 파리를 수집합니다.
2. 코드에서 실험자 사용 실제 유전자형 / 변형에 멀게됩니다 그러한 그들을 분류.
3. 감청에 의해 노출 실에 8 파리를 전송합니다. 마취하지 마십시오.
4. 그것이 쉽게 볼 수 있도록 200 증거 에탄올 음식 염료, 예 : 산성 블루 9의 작은 금액을 추가합니다.
5. 0.5 ML의 에탄올과 코팅은 유리 플러그의 바닥이나 면화 공.
6. 노출 약병에 에탄올 플러그를 삽입합니다. 알코올은 유리병에, 아니라 유리병의 벽을 향해 마주보고 있는지 확인하십시오.
7. 세는 타이머를 시작합니다.

3. 기록 에탄올 유도 중독증

1. 타이머 후 각 분 시작은, 파리를 놀라게하고 10 초 동안 그들을 관찰하기 위해 벤치에 노출 챔버를 누릅니다.
2. 각 분간 정지 파리의 번호를 기록합니다. 파리는 그들이 귀찮게 안할 수 없다면 한 위치에 남아, 또는 빠르게 전체 10 초 관찰 - 기간 내내 자신의 날개를 진동 정지됩니다. 이러한 파리의 대부분 빠른 날개 운동의 기간 사이에 고정되기 때문에 후자 파리는 고정 간주됩니다. 파리는 그들이 귀찮게하고 거리 및 / 또는 유리 벽까지 걸을 수있다면 고정되지 않습니다.
3. 4 개 이상 날아가 정지로 기록하는 경우 노출 재판이 완료됩니다.
4. 파리를 취소하고 나중에 재사용을위한 노출 챔버 공기를 내보 내줘.

4. 50 % 진정 작용 시간을 결정

50 %의 진정 작용 (ST50)하는 데 걸리는 시간은 8 파리 그 중 넷은 고정 남아있는 에탄올의 노출의 시작 후 시간입니다. 이것은 다음과 같이 결정됩니다 :
어느 : 정확히 네 파리 고정하는 첫번째 측정 분.
또는 : 이하보다 4 파리 (Y1)가 한 번에 포인트 (분 X), 그리고 다음 측정 시점에 개 이상 (Y2) (X 일분) 공식을 사용하여 다음 선형 보간 ST50에 정지하는 경우 :
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X

5. 공차를 결정하는 노출을 반복

파리를 노출

1. 실험에 사용된 야생 형 제어 변형에 대한 ST50 (WT)을 결정합니다.
2. 위에서 설명한 에탄올로 파리의 실험 그룹을 쉽게받을 수 있습니다.
3. 그들 ST50 (1) 측정하지만, 당신이 시간을 2 배 ST50 (WT)를 도달할 때까지 노출로 진행합니다.
4. 빈 식품 약병에 다시 파리를 전송하고, 4 시간 동안 기다려.
5. 파리를 다시 노출하고, 노출 2 ST50 (2) 결정됩니다.

허용 오차를 결정

x100 - (1 ST50 (2) / ST50 (1))로 %의 허용 오차를 계산합니다.

6. 대표 결과 :

여기에 나와 우리가 유전자형과 복용량 당 파리 6-8 유리병과 함께 얻은 몇 가지 대표적인 결과입니다. 당신의 표준 오차가 크게 확대되면 체계적인 문제는 가능성이 발생했습니다. 에탄올은 챔버가 같은 볼륨되는 노광 실에 얼굴을하고 있는지 확인하십시오.

야생 유형의 그림 1. 선량 반응 곡선은 에탄올의 증가 비율에 노출 날아. 파리의 여덟 병은 복용과 성별에 따라 노출되었습니다. 복용에 걸쳐 ST50가 증가 에탄올 선량 (P는 <0.001)로 크게 감소하면서 남성과 여성의 파리는 각 복용량 (P> 0.22, 2 방향 ANOVA)에서 동일한 ST50을 보여줍니다. 오버 혼잡 병에서 파리 참고 건강한 병에서보다 대폭 작은 수 있으며,이 크기의 차이가 ST50에 영향을 줄 수 있습니다. 15-20 여성과 시드 각 병 병마다 최적의 애벌레 밀도를 얻을 1~2일위한 누워.

그림 2. 중 90 %, 또는 백퍼센트 에탄올로 파리를 노출은 흰색 rabbit1 mutation2 (P <0.001, 2 방향 ANOVA)에 의한 이전에 설명한 에탄올 저항을 재현.

그림 3. 4 시간 복구 간격에 의해 간격, 100 % 에탄올에 노출을 반복, 두 번째 노출 (P <0.001, 이점 t 후 ST50에서 상당한 증가 원인테스트). 파리가 첫 번째 노출 (두 번 자신의 나의 적 ST50에 해당하는) 동안 24분에 대한 노출다고합니다. 시간 (12 분)의 짧은 금액에 대한 노출을 다시 노출 (데이터가 표시되지 않음)에 따라 ST50에 상당한 증가를 일으키지 않았다.

이 프레 젠 테이션에서, 우리는 베인튼 외 의해 설명되어 이전 assays에 따라 에탄올 유발 중독증을​​ 결정하는 간단한 방법을 설명합니다. 2000 ¹ 및 Rothenfluh 외. 2006 ^2. 알코올 유발 진정 작용은 알코올 음주 환경 설정 ³ 상관 있기 때문에,이 분석은 알코올 사용 장애 연구 관련입니다. 설명 분석은 놀라게 유발 부정 geotaxis에 따라, 어떻게 알코올 노출이 타고난 응답을 방해합니다. 노출를 시작하기 전에, 모든 파리는 음식 약병에서 파리를 감청 후, 그들이 모두 10초 관측 시간 내에 아래에서 위로 이동합니다 즉, 같은 놀라게 정상적인 반응을 보여주 있는지 확인하십시오. 감소 부정 geotaxis하는 데 파리의 예는 다음과 플레이에 민감한 발작 돌연변 ^5, 도파민 뉴런 ⁶ 변성에 의한 운동 - 결함 파리를 포함합니다.

설명 분석은 비교적 간단하다하더라도, 두 변수가 재현성 결과를 보장하기 위해 가장 주목 만하다. 첫째, 모든 노출 튜브는 동일한 볼륨해야합니다. 이것은 유리병의 바닥 같은 음식 + 유리병 플러그 / 목화 공의 볼륨뿐만 아니라 에탄올이 포함된 플러그인은 모든 병에 대해 동일한 거리를 삽입을 포함하고 있는지 확인이 포함됩니다. 완전히 빈 유리병이 분석에 사용하지만, 그것은 분석의 처리량을 줄이는 더 이상 ST50 가치로 연결하실 수 있습니다.

이 분석은 또한 반복 노출시 에탄올 개발 내성 파리의 양을 결정하기 위해 적합합니다. 반복 노출을 할 때 변수의 수를 고려되어야합니다. 첫째, 남북 노출 간격은 여기 4시간로 설명되어 있습니다. 이 변수는 변경하지만, 우리는 그것이 첫 번째 노출 에탄올의 허가를 위해 2 시간보다 낮을 수 없습니다 권장 수 있습니다. 슐츠 외를 참조하십시오. 에탄올 허용 개발 및 부패의 반응 속도론 2000 ^4. 고려해야 할 두 번째 변수는 첫 번째 노출의 기간입니다. 이것은 분명 제어 및 실험 파리에 대해 동일합니다. 그러나,이 이러한 플라이 계통 모두에 전달 에탄올 같은 금액을 초래하지 않을 수 있습니다. 진정 파리 일찍 나중 - sedating 변형보다 높은 복용량가 나타날 수 있습니다 진정제 변형 따라서 Active 파리 ² 이상의 에탄올을 흡수하고, 따라서 더 높은 초기 복용으로 인해 더 많은 관용을 개발. 초기 ST50 (1)의 차이를 보여 종자의 내성 개발을 비교할 때 우리는 강력하게 독자를주의하십시오.

우리가 여기서 설명하는 분석 쉽고 reproducibly 알코올에 파리 행동 반응을 결정하는 유용한 도구입니다.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 중요한 원고의 읽기, 도움이 토론에 대한 실험실의 구성원에 대한 Aylin Rodan 감사합니다. 이 연구는 NIH, R01AA019526에 의해 지원됩니다.

1. R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai, C. S. Singh, M. S. Moore et al., Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
2. A. Rothenfluh, R. J. Threlkeld, R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai et al., Cell 127, 199-211 (2006).
3. A. V. Devineni and U. Heberlein. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
4. H. Scholz, J. Ramond, C. S. Singh, and U. Heberlein. Neuron 28, 261-271 (2000).
5. M. J. Allen, T. A. Godenschwege, M. A. Tanouye, and P. Phelan. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
6. M. B. Feany, and W. W. Bender. Nature 404, 394-398 (2000).

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