Простой способ определения этанола Чувствительность в Мухи

Maples, T., Rothenfluh, A. A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies. J. Vis. Exp. (48), e2541, doi:10.3791/2541 (2011).

Малые дозы этанола причиной мухи, чтобы стать гиперактивными, в то время как высокие дозы седативных. Чувствительность к этанолу вызванных торможение данного штамма летать коррелирует с этанолом предпочтения, что штамм с, и, следовательно, седативные препараты, весьма актуальной мерой для изучения генетики алкоголя ответы и питья. Мы продемонстрируем простой способ предоставления летит в этанол и измерить его опьяняющий эффект. Анализа мы описываем может определить, обостренная чувствительность, а также этанол терпимости индуцированных повторить экспозицию. Она не требует установки технически участвуют, и поэтому могут быть применены в любой лаборатории с основными инструментами культуры летать.

1. Создание экспозиции камеры

1. Вырезать флакон плагин в половине использованием лезвия бритвы. Вместо этого можно использовать ватные шарики.
2. Нажмите половину флакона вилку, или ватным тампоном, на дно флакона пищи, чтобы сделать гладкую поверхность, что мухи не будут застревать дюйма
3. Если сделать несколько камер воздействия, убедитесь, что плагин флакон и пищевой занимать такой же объем в каждой камере. Отпечаток на стороне флакона может способствовать этому.

2. Разоблачение мух

1. Соберите 8 мухи одного пола, возраста 1-5 дней, за день до воздействия на регулярные флаконах пищу без дрожжей.
2. Этикетка их в код, например, что экспериментатор знал о фактической генотип / штамм используется.
3. Передача восемь летит в экспозиции камеры, нажав. Не анестезию.
4. Добавить небольшое количество пищевой краситель, например, кислоты синий 9, до 200 доказательство этанол, чтобы сделать ее хорошо видно.
5. Пальто дно флакона вилку, или ватным тампоном, 0,5 мл этанола.
6. Вставьте вилку в этаноле воздействия флаконе. Убедитесь, что алкоголь, направленным на флаконе, а не к стенке флакона.
7. Начало таймер, отсчитывающий вверх.

3. Запись этанол-индуцированной интоксикации

1. Каждую минуту после того, запускается таймер, нажмите экспозиции камеры на скамейке, чтобы поразить мух и наблюдать за ними в течение десяти секунд.
2. Запись числа стационарных мух за каждую минуту. Мухи являются стационарными, если они не могут выйти их спинами, остаются в одном месте, или быстро вибрируют крылья в течение всего десяти секунд наблюдения периода. Последний мух считается стационарным, поскольку подавляющее большинство этих мух стационарных между периодами быстрого движения крыла. Мухи не являются стационарными, если они могут сойти спиной и уйти и / или до флакона стене.
3. Экспозиции суда заканчивается, когда 4 или больше мух, отражаются как стационарные.
4. Отменить мух и выпускать воздух из экспозиции камеры для дальнейшего использования.

4. Определить время до 50% седации

Время до 50% седации (ST50) является время после начала воздействия этанола, когда четыре из восьми мухи остаются неподвижными. Это определяется следующим образом:
Либо: на первой минуте измерения, когда ровно четыре мухи являются стационарными.
Или: если менее чем за четыре мухи (Y1) являются стационарными в одной временной точке (минута X), и более чем в четыре (Y2) на следующей точке измерения времени (минута X +1), то линейно интерполировать ST50 по формуле:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X

5. Повторите воздействия для определения допуска

Разоблачение мух

1. Определите ST50 (вес) для дикого типа контрольного штамма использовали в своем эксперименте.
2. Expose экспериментальных групп мух к этанолу, как описано выше.
3. Мера их ST50 (1), но продолжают разоблачать пока не дойдете до времени 2x ST50 (вес).
4. Трансфер снова летит в пустой флакон пищи, и удерживайте в течение 4 часов.
5. Повторно выставить мух, и определить, ST50 (2) воздействия 2.

Определение толерантности

Рассчитать толерантности в% (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100.

6. Представитель Результаты:

На рисунке вы видите, некоторые репрезентативные результаты были получены с 6-8 флаконов мух на генотип и дозы. Если стандартная ошибка существенно больше, то систематические проблема действительно произошло. Убедитесь, что этанол лица в экспозиции камеры, и что камеры того же объема.

Рисунок 1. Дозовой кривой дикого типа мухи подвергается увеличение доли этанола. Восемь флаконов мух были выставлены на дозу и секс. Мужские и женские мухи показывают те же ST50 при каждой дозе (р> 0,22, 2-полосная ANOVA), в то время ST50 через дозах значительно уменьшается с увеличением дозы этанола (р <0,001). Обратите внимание, что летит из переполненных бутылки может быть существенно меньше, чем у здоровых бутылки, и эта разница размеров может повлиять ST50. Семенной каждую бутылку с 15-20 женщин укладки в течение 1-2 дней, чтобы получить оптимальную плотность личиночной за бутылку.

Рисунок 2. Разоблачение мухи либо этанол 90%, или 100% воспроизводит ранее описанных этанола сопротивление, вызванное белый rabbit1 mutation2 (р <0,001, 2-полосная ANOVA).

Рисунок 3. Повторите экспозиции до 100% этанол, расположенных на 4-часовой интервал восстановления, приводит к значительному увеличению ST50 после второго облучения (р <0,001, парные т-Тест). Обратите внимание, что мухи были выставлены в течение 24 минут во время первой экспозиции (соответствующий два раза превышающую их наивны ST50). Экспозиции для более короткий промежуток времени (12 минут) не вызывало значительное увеличение ST50 при повторном воздействии (данные не приведены).

В этой презентации, мы наметили простой способ определения этанола вызванной интоксикацией на основе предыдущих анализов описывается Бейнтон и соавт. 2000 ^1, и Rothenfluh и соавт. 2006 ^2. Так как алкоголь-индуцированного седация коррелирует с употреблением алкоголя предпочтение ^3, этот анализ имеет важное значение для изучения нарушений употребления алкоголя. Анализа, описанного основана на испуга вызванного отрицательными geotaxis, и как алкоголь влияет на подверженность этой врожденной реакции. Перед началом экспозиции, убедиться, что все мухи показывают, нормальная реакция на такого испуга, то есть после нажатия вниз летит в пищу флаконе, все они должны подняться со дна в течение 10 секунд времени наблюдения. Примеры мух сократив отрицательные geotaxis включают взрыва чувствительных к захвату мутантов ⁵ и передвижения с дефицитом мухи вызвано дегенерацией дофаминовых нейронов ^6.

Хотя описанные анализа относительно проста, двух переменных заслуги наибольшего внимания для обеспечения воспроизводимых результатов. Во-первых, все экспозиции флаконы должны быть того же объема. Это включает в себя то, чтобы дне флакона содержит тот же объем пищи + флакон плагин / ватным тампоном, а также вставки этанол содержащие плагин же расстояние для каждого флакона. Совершенно пустой флакон можно использовать для этого теста, но это приводит к более ST50 значения, снижая пропускную способность анализа.

Этот анализ также подходит для определения суммы толерантности мухи на разработку повторить воздействие этанола. Число переменных должны быть рассмотрены при выполнении повторить экспозиций. Во-первых, между воздействием интервал здесь описан как 4 часа. Эта переменная может быть изменена, но мы рекомендуем составлять не менее 2 часов, чтобы обеспечить оформление этанола из первой экспозиции. Смотрите Scholz и соавт. 2000 ⁴ для кинетики этанола развития толерантности и распада. Вторая переменная, чтобы рассмотреть, является длительность первой экспозиции. Это, очевидно, должен быть одинаковым для контроля и экспериментальных мух. Однако, это не может привести к таким же количеством этанола доставляется на оба эти штаммы летать. Sedated мухи поглощать больше этанола, чем активные мухи ^2, поэтому напряжение, успокаивает ранее, может получать более высокую дозу, чем позже, седативные напряжения, и таким образом развивать больше терпимости в связи с более высокой начальной дозы. Мы настоятельно предостеречь читателя при сравнении развития толерантности штаммов, которые показывают различия в начальных ST50 (1).

Анализ описанных здесь является полезным инструментом в легко и воспроизводимо определения мухи поведенческих реакций на алкоголь.

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы благодарим Айлин Родан за критическое прочтение рукописи, и члены лаборатории за полезные обсуждения. Это исследование поддержано НИЗ, R01AA019526.

1. R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai, C. S. Singh, M. S. Moore et al., Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
2. A. Rothenfluh, R. J. Threlkeld, R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai et al., Cell 127, 199-211 (2006).
3. A. V. Devineni and U. Heberlein. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
4. H. Scholz, J. Ramond, C. S. Singh, and U. Heberlein. Neuron 28, 261-271 (2000).
5. M. J. Allen, T. A. Godenschwege, M. A. Tanouye, and P. Phelan. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
6. M. B. Feany, and W. W. Bender. Nature 404, 394-398 (2000).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.