ハエでエタノールの感度を測定するために簡単

Maples, T., Rothenfluh, A. A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies. J. Vis. Exp. (48), e2541, doi:10.3791/2541 (2011).

エタノールの原因の低用量は高用量で鎮静している間、非常に活発になるために飛ぶ。与えられたハエ株のエタノール誘発性鎮静に対する感度は、その株のエタノールの嗜好と相関し、したがって、鎮静は、アルコールの反応と飲酒の遺伝学を研究するために、関連性の高い指標です。我々はその酔わせる効果を、エタノール及び測定するためにハエを公開する簡単な方法を示しています。我々が記述するアッセイは、繰り返しの曝露により誘発される急性感度だけでなく、エタノール耐性を決定することができます。それは技術的に関与してセットアップを必要としないため、基本的なフライの文化のツールを使っての検査に適用することができます。

1。暴露室を作成する

1. カミソリの刃を使用して半分にバイアルのプラグをカット。また、綿球を使用してください。
2. ハエがログイン立ち往生しないように滑らかな表面を作るために食品のバイアルの底に、バイアルのプラグの半分、または綿のボールをプッシュ
3. 複数の曝露チャンバーを作る場合、バイアルのプラグと食品が各チャンバー内の同じ容積を取ることを確認してください。バイアルの側面のマークはこれを容易にすることができます。

2。ハエを公開

1. 酵母のない通常の餌をバイアルに露出する前に1つ性別、年齢1-5日、一日の8ハエを集める。
2. 実験者が実際に使用される遺伝子型/株に盲検化されるように、コード内でラベルを付けます。
3. タップして、曝露チャンバー8つのハエを移す。麻酔しないでください。
4. それは簡単に見えるように200プルーフのエタノールに食品染料、例えば、アシッドブルー9、少量のを追加。
5. 0.5mlのエタノールとコートはバイアルのプラグの下部、または綿ボール、。
6. 露出のバイアル瓶にエタノールのプラグを差し込みます。アルコールは、バイアルに、ではなくバイアルの壁の方を向いていることを確認してください。
7. カウントアップタイマーを開始します。

3。記録エタノール誘発性の中毒

1. タイマーが開始された後、各分には、ハエを驚愕し、10秒のためにそれらを観察するためにベンチに暴露室をタップします。
2. 毎分固定ハエの数を記録。ハエは、彼らが自分の背中から降りることができない場合は、1つの場所に残っている、または急速に全体の10秒の観測期間を通じて、その翼を振動さ固定です。これらのハエの大多数は急速な翼の運動の期間の間静止しているので、後者のハエは、静止とみなされます。ハエは、彼らが自分の背中から降りるとの距離および/またはバイアルの壁まで歩くことができれば静止していないです。
3. 4つ以上のハエが固定として記録されるときの露光試験が終了しています。
4. ハエを破棄し、後で再利用するために暴露室の空気を外に出して。

4。 50％の鎮静に時間を決定する

50％の鎮静（ST50）までの期間は、8ハエの4つは静止したままエタノールの暴露の開始後の時間です。これは、次のように決定されます。
次のいずれかの操作を正確に4ハエが静止している最初の測定分。
または：以下つ以上のハエ（Y1）は1時点（分X）、そして次の測定時点においてつ以上（Y2）（X +1分）、式を使用して線形補間ST50で静止している場合：
ST50 =（4 - Y1）/（Y2 - Y1）+ X

5。許容範囲を決定するために露出を繰り返して

ハエを公開

1. あなたの実験で使用されている野生型の対照株のST50（重量）を決定します。
2. 前述のようにエタノールにハエの実験群を公開。
3. 彼らのST50（1）を測定しますが、時間2倍ST50（重量）に達するまで公開し続ける。
4. バックの空の食品用バイアルにハエを移し、4時間保持する。
5. ハエを再公開し、露出2のST50（2）を決定する。

許容範囲を決定する

X100 - （1 ST50（2）/ ST50（1））のような％の許容誤差を計算する。

6。代表的な結果：

ここに示されている、我々は遺伝子型と投与量あたりのハエの6-8バイアルで得られたいくつかの代表的な結果は次のとおりです。あなたの標準誤差が大幅に大きい場合、体系的な問題が可能性が発生しました。エタノールは、曝露チャンバーに直面する、とチャンバーが同じボリュームであることを確認してください。

野生型の図1。用量反応曲線は、エタノールの増加割合にさらさハエ。ハエの八バイアルは、投与量及び性別ごとに暴露された。用量間ST50が増加し、エタノールの投与量（P <0.001）で有意に減少する男性と女性のハエは、（P> 0.22、2ウェイANOVA）各用量で同じST50を示す。過密ボトルの便を運行する航空会社はノートでは、健康なボトルのものより大幅に小さくすることができ、このサイズの違いは、ST50に影響を与える可能性があります。 15から20人の女性と種子各ボトルは、ボトルごとに最適な幼虫の密度を得るために1-2日間敷設。

図2 90％、または100％エタノールのいずれかにハエを公開するにはmutation2白ウサギ（P <0.001、2ウェイANOVA）によって引き起こされる前述のエタノール耐性を再現。

図3：4時間回復の間隔を隔て、100％エタノールに露出を繰り返し、秒露光（P <0.001、対応のあるtの後にST50の大幅な増加を引き起こす- テスト）。ハエが最初に暴露（そのNAのVE ST50倍に相当）中に24分間暴露されたことに注意してください。短い時間（12分）のための暴露は、再暴露（データは示さず）によりST50の著しい増加を引き起こさなかった。

本発表では、我々はバイントンらによって記述された以前のアッセイに基づいて、エタノール誘発性中毒を判断する簡単な方法の概要を示している。 2000 ^1、およびRothenfluhら。 2006 ^2。アルコール誘発性の鎮静が飲酒の嗜好³と相関しているので、このアッセイは、アルコール使用障害の研究に関連しています。記載のアッセイは、驚愕誘発性負の走地性に基づいており、どのようにアルコール暴露は、この生得的反応に干渉されています。エクスポージャーを開始する前に、すべてあなたのハエが食品のバイアルでハエをタップした後、彼らはすべて10秒の観測時間内に下から上に移動する必要があるすなわち、そのような驚愕に正常な応答を示すことを確認してください。減少負の走地性を持つハエの例としては、ビッグバンに敏感な発作の変異体⁵と、ドーパミンニューロン⁶の変性による運動欠損ハエが含まれています。

記載のアッセイは比較的単純であるにもかかわらず、二つの変数は、再現性のある結果を確保するために最も注目に値する。最初に、すべてのエクスポージャーのバイアルは、同じボリュームにする必要があります。これは、バイアルの底部は食品+バイアルプラグ/コットンボールだけでなく、エタノールを含有するプラグインごとにバイアルに同じ距離を挿入するのと同じ量が含まれているかどうかの確認が行われます。完全に空のバイアルは、このアッセイに使用しているが、アッセイのスループットを減少させる、より長いST50の値を導くことができる。

このアッセイはまた、繰り返しのエタノール曝露によって開発公差のハエの量を決定するために適しています。繰り返しの曝露を行うときに変数の数を考慮する必要があります。最初に、間露光間隔は、ここで4時間として記述されています。この変数は変更可能ですが、我々はそれが最初の曝露からエタノールのクリアランスを確保するために、2時間よりも低くしないことをお勧めすることができます。ショルツらを参照してください。エタノール耐性の発達と減衰の速度論のための2000 ^4。考慮する2番目の変数は、最初の曝露の期間です。これは明らかに制御し、実験的なハエで同じでなければなりません。しかし、これは両方のこれらのハエの系統に供給されるエタノールの同量になる場合があります。鎮静ハエは、以前の後、鎮静株よりも高い線量を受けることがsedatesひずみしたがって、アクティブなハエ²より多くのエタノールを吸収するため、より高い初期投与に起因する多くの耐性を開発する。最初のST50（1）の違いを示す菌株の耐性の開発を比較するとき私達は強くリーダーを注意してください。

我々はここで説明するアッセイは、簡単にかつ再現性アルコールにハエ行動反応を決定するのに便利なツールです。

利害の衝突は宣言されません。

我々は、重要な原稿の読み取り、および有用な議論のための研究室のメンバーのためにAylinロダンに感謝。この研究は、NIH、R01AA019526によってサポートされています。

1. R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai, C. S. Singh, M. S. Moore et al., Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
2. A. Rothenfluh, R. J. Threlkeld, R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai et al., Cell 127, 199-211 (2006).
3. A. V. Devineni and U. Heberlein. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
4. H. Scholz, J. Ramond, C. S. Singh, and U. Heberlein. Neuron 28, 261-271 (2000).
5. M. J. Allen, T. A. Godenschwege, M. A. Tanouye, and P. Phelan. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
6. M. B. Feany, and W. W. Bender. Nature 404, 394-398 (2000).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.