Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

Maples, T., Rothenfluh, A. A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies. J. Vis. Exp. (48), e2541, doi:10.3791/2541 (2011).

Baixas doses de etanol causa voa para tornar-se hiperativas, enquanto altas doses sedativas. A sensibilidade ao etanol induzida sedação de uma cepa voar dado é correlacionado com a preferência que a tensão s etanol, e, portanto, a sedação é uma medida altamente relevantes para o estudo da genética das respostas de álcool e beber. Nós demonstramos uma forma simples para expor voa para o etanol e medir seus efeitos inebriantes. O ensaio descrevemos pode determinar a sensibilidade aguda, assim como tolerância ao etanol induzida pela exposição repetida. Ele não requer uma instalação tecnicamente envolvidos, e pode, portanto, ser aplicada em qualquer laboratório com as ferramentas básicas da cultura voar.

1. Criando a câmara de exposição

1. Cortar um plug frasco pela metade utilizando uma lâmina de barbear. Alternativamente, use bolas de algodão.
2. Empurrar o meia ficha frasco, ou a bola de algodão, para o fundo de um frasco de comida para fazer uma superfície lisa que as moscas não vai ficar preso dentro
3. Se fazer câmaras de exposição múltipla, certifique-se que o plugue do frasco e alimentos ocupam o mesmo volume em cada câmara. A marca na parede do frasco pode facilitar este processo.

2. Expondo as moscas

1. Colete 8 voa de um sexo, idade 1-5 dias, o dia antes da exposição em frascos de alimentos regulares, sem fermento.
2. Classificá-los em código, de modo que o experimentador é cego para o genótipo real / cepa utilizada.
3. Transferência dos oito voa para as câmaras de exposição tocando. Não anestesiar.
4. Adicionar uma pequena quantidade de alimentos corantes, por exemplo, ácido azul 9, a 200 etanol prova para torná-lo facilmente visível.
5. Brasão fundo do frasco de um plug, ou bola de algodão, com 0,5 ml de etanol.
6. Insira o plugue de etanol para o frasco de exposição. Garantir que o álcool é voltada para o frasco, e não em direção à parede do frasco.
7. Iniciar um temporizador de contagem acima.

3. Intoxicação registro induzida por etanol

1. Cada minuto após o timer é iniciado, toque na câmara de exposição no banco de reservas para surpreender as moscas e observá-los por dez segundos.
2. Registrar o número de moscas estacionárias para cada minuto. Moscas são estacionários se eles não podem sair de costas, permanecem em um local, ou rapidamente vibrar as asas durante toda a dez segundos período de observação. As moscas últimos são considerados estacionários porque a grande maioria destas moscas são estacionários entre os períodos de movimento rápido das asas. Moscas não são estacionários se eles podem sair as costas e ir embora e / ou até a parede do frasco.
3. Um ensaio de exposição termina quando quatro ou mais moscas são registrados como estacionário.
4. Descartar moscas e deixar o ar câmara de exposição para fora para reutilização posterior.

4. Determinar o tempo de sedação 50%

O tempo para sedação de 50% (ST50) é o tempo após o início da exposição ao etanol, quando quatro dos oito moscas permanecem estacionários. Isto é determinado da seguinte forma:
Ou: no minuto primeira medição, quando exatamente quatro moscas são estacionárias.
Ou: se menos de quatro moscas (Y1) são estacionários em um ponto do tempo (X minutos), e mais de quatro (Y2) no próximo ponto de medição do tempo (minutos X +1), então linearmente interpolar o ST50 utilizando a fórmula:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X

5. Repita a exposição para determinar a tolerância

Expondo as moscas

1. Determinar o ST50 (wt) para uma estirpe de controlo do tipo selvagem utilizado na experiência.
2. Expor os grupos experimentais de moscas para o etanol, como descrito acima.
3. Medir a sua ST50 (1), mas continuam a expor até chegar o tempo 2x ST50 (wt).
4. Transferência das moscas de volta em um frasco vazio de alimentos, e segure por 4 horas.
5. Re-expor as moscas, e determinar o ST50 (2) da exposição 2.

Determinar a tolerância

Calcule a tolerância em% como (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100.

6. Resultados representativos:

Mostrados aqui, são alguns resultados representativos obtivemos com 6-8 frascos de moscas por genótipo e dose. Se o seu erro padrão é substancialmente maior, então um problema sistemático provavelmente ocorreu. Certifique-se de que o etanol enfrenta nas câmaras de exposição, e que as câmaras são o mesmo volume.

Figura 1. Curva de resposta de dose do tipo selvagem voa expostos a aumento do percentual de etanol. Oito frascos de moscas foram expostos por dose e sexo. Machos e das fêmeas mostram o ST50 mesmo em cada dose (p> 0,22, 2-way ANOVA), enquanto o ST50 em doses diminui significativamente com a dose crescente de etanol (p <0,001). Note que voa de superlotado garrafas pode ser substancialmente menor do que os de garrafas saudável, e esta diferença de tamanho pode afetar o ST50. Garrafa de semente, cada uma com fêmeas 15-20 postura por 1-2 dias para obter a densidade larval ótimo por garrafa.

Figura 2. Expondo voa para tanto o etanol 90%, ou 100% reproduz o anteriormente descrito etanol resistência causada pelo branco rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-way ANOVA).

Figura 3. Repita a exposição ao etanol a 100%, espaçadas por um intervalo de recuperação de 4 horas, causa um aumento significativo na ST50 após a segunda exposição (p <0,001, t emparelhado-Teste). Note que as moscas foram expostos por 24 minutos durante a primeira exposição (correspondente a duas vezes ve nd suas ST50). Exposição para um curto período de tempo (12 minutos) não causou um aumento significativo na ST50 sobre a re-exposição (dados não mostrados).

Nesta apresentação, nós esboçamos uma maneira simples para determinar a intoxicação induzida por etanol com base em ensaios anteriores descritos por Bainton et al. 2000 ^1, e Rothenfluh et al. 2006 ^2. Desde sedação induzida pelo álcool está correlacionado com a preferência de beber álcool ^3, este ensaio é relevante para o estudo dos transtornos por uso de álcool. O ensaio descrito baseia-se em sobressalto induzida geotaxis negativo, e como a exposição de um álcool interfere com a resposta inata. Antes de iniciar a exposição, certifique-se todas as suas moscas mostram uma resposta normal a um tal de sobressalto, isto é, depois de tocar as moscas dentro do frasco de alimentos, todas devem subir de baixo para dentro de um tempo de observação de 10 segundos. Exemplos de moscas ter reduzido geotaxis negativos incluem mutantes bang-sensível apreensão ^5, e com deficiência de locomoção moscas causada por degeneração dos neurônios dopaminérgicos ^6.

Mesmo que o ensaio descrito é relativamente simples, duas variáveis ​​merecem a maior atenção para garantir a reprodutibilidade dos resultados. Primeiro, todos os frascos de exposição deve ser o mesmo volume. Isto inclui assegurar que o fundo do frasco contém o mesmo volume de alimentos bola + frasco ficha / algodão, bem como inserir o plug-etanol contendo a mesma distância para cada frasco. Um frasco completamente vazio pode ser utilizado para este ensaio, mas leva a valores mais ST50, diminuindo a transmissão do ensaio.

Este ensaio também é adequado para determinar a quantidade de moscas tolerância desenvolver após a exposição de etanol repetir. Uma série de variáveis ​​devem ser consideradas quando se faz exposições repetidas. Primeiro, o intervalo inter-exposição é aqui descrito como 4 horas. Esta variável pode ser alterado, mas recomendamos que não seja inferior a 2 horas, para garantir a liberação de etanol a partir da primeira exposição. Ver Scholz et al. 2000 ⁴ para a cinética de desenvolvimento do etanol de tolerância e decadência. A segunda variável a considerar é a duração da primeira exposição. Isto, obviamente, tem que ser o mesmo para o controle e as moscas experimental. No entanto, isto não pode resultar na mesma quantidade de etanol entregue a estas duas estirpes voar. Moscas sedado absorvem mais etanol do que as moscas ativo ^2, portanto, uma tensão que sedates anteriores podem receber uma dose mais elevada do que uma cepa mais tarde sedativo, e assim desenvolver mais tolerância devido a uma dose inicial mais elevado. É altamente advertir o leitor ao comparar o desenvolvimento de tolerância de estirpes que mostram diferenças na ST50 inicial (1).

O ensaio aqui descrito é uma ferramenta útil em determinar facilmente reproduzível e moscas respostas comportamentais ao álcool.

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecemos a Aylin Rodan para a leitura crítica do manuscrito, e os membros do laboratório para discussão útil. Esta pesquisa é apoiada pelo NIH, R01AA019526.

1. R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai, C. S. Singh, M. S. Moore et al., Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
2. A. Rothenfluh, R. J. Threlkeld, R. J. Bainton, L. T-Y. Tsai et al., Cell 127, 199-211 (2006).
3. A. V. Devineni and U. Heberlein. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
4. H. Scholz, J. Ramond, C. S. Singh, and U. Heberlein. Neuron 28, 261-271 (2000).
5. M. J. Allen, T. A. Godenschwege, M. A. Tanouye, and P. Phelan. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
6. M. B. Feany, and W. W. Bender. Nature 404, 394-398 (2000).

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