Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

1. Intratrakeal Entübasyon tarafından Akciğer Enfeksiyonu

1. Fareler tartılır ve isteğe bağlı olarak, işaretleri kulaklara kolay tanımlanması için yapılabilir.
2. Intraperitoneal inokülasyon ile fareler anestezi ketamin (g fare kilo başına 100 mikrogram) ve xylazine (farenin ağırlığının gramı başına 10 mikrogram).
3. Tam anestezi kadar kafeslere yerleştirin fareler. Pedal refleks kontrol etmek için onların ayak pedleri sıkıştırın. Fare azaltılmış ya da herhangi bir refleks reaksiyon göstermesi gerekir.
4. Sırtında uzanan entübasyon standı üzerinde fare yerleştirin.
5. Entübasyon durmak için bir lastik bant saptamak ve sonra farenin üst kesici dişlerin altına koyun. Entübasyon standı üzerine bacaklar ve kollar düzeltmek için bant kullanın.
6. Forseps kullanarak ağız hafifçe dışarı tougue taşıyın.
7. Ağız içinde octoscope spekulum yerleştirin ve gırtlak açılması görülene kadar orofarinks içine bakmak.
8. Catether hub kadar trakea içine kateteri ile kaplı Advance kılavuz tel kesiciler. Kılavuz teli çıkarın. Göğüs genişlemesi gözlemlemek ve doğru entübasyon onaylamak için, kateteri içine hava koyun.
9. 50 mcL bakteriyel 1 ml şırınga kullanarak kateteri yoluyla çözüm (Bacillus Calmette Guerin (BCG) laboratuvarında inşa tıklayın böceği kırmızı lusiferaz (CBRLuc), ifade kullanılır, ancak herhangi bir ışıldayan bakteri suşunun kullanılabilir gösterilir görüntüleri) enjekte edilir.
10. Fare bir kafes yerleştirin ve anestezi kurtarma sırasında gözlemlemek.

2. Hayvan Anesthetization ve Biyoparlaklık Görüntüleme Hazırlık

Fareler XGI-8 Gaz Aneshesia Sistemi kullanılarak izofluran anestezisi.

1. XGI-8 anestezi sistemi çalıştırmadan önce, her bir kömür filtre spreyi tartmak ve ağırlığı ve tarih yazmak. 50 gram ağırlığı başlangıç ​​ağırlığının üzerinde ise, yeni bir teneke kutu ile değiştirin.
2. Buharlaştırıcı izofluran seviyesini kontrol edin ve gerekirse doldurun.
3. XGI-8 anestezi sistemi ön tahliye pompası açın ve 8 lpm (minuite litre) olarak ayarlanır.
4. , Yüksek basınçlı silindir oksijen kaynağı açın ve 55 psig olarak ayarlayın.
5. XGI-8 anestezi sistemi ön geçiş oksijen (yeşil) açın.
6. Gaz akışı seviyesini ayarlamak için görüntüleme odasına gaz akışını açın. 0.25 lpm ayarlayın ve ardından gaz akışı kapatın.
7. Gaz akışı seviyesini ayarlamak için anestezi indüksiyonu odasına gaz akışını açın. 1.5 lpm ayarlayın ve ardından gaz akışı kapatın.
8. Buharlaştırıcı ve yüzde 2-2.5 seti ile izofluran açın. Izofluran düzeyde kullanılan hayvanların ve kilo sayısına bağlı olarak ayarlanabilir.
9. Indüksiyon odasına fareler koyun ve kapağını kapatın. Indüksiyon odasına gaz akışını açın. 5 oda yerleştirin fareler - 10 minuites tamamen uyutmak kadar.
10. Gözlerin optik fare görüntüleme sırasında gözleri korumak ve görüntüleme odasında fareler anestezi manifoldunun üzerine burun konileri biri yere merhem sürün. Fareler arasındaki ışık baffle bitişik hayvan konular üzerine ışık yansımalarını önlemek için kullanın.
11. Intraperitoneal inokülasyon ile luciferase (150 mikrogram / gram vücut ağırlığı) enjekte edilir.

3. Biyoparlaklık Görüntüleme

1. Yaşayan Görüntüleme Yazılımı başlatın.
2. Sistemi başlatılmadı ise, IVIS Görüntüleme sistemi başlatmak.
3. IVIS satın alma kontrol paneli sıra kurulum tıklayarak görüntüleme parametreleri ayarlayın.
   Görüntüleme Modu lüminesans ve fotoğraf seçin. DLIT 3D rekonstrüksiyon yürütmek için seçenek istenirse, görüntü dizisinin bir parçası olarak, fotoğraf, parlak ve yapısal ışık görüntüleri seçin.
   Pozlama süresi 0.5 saniye ile 10 dakika arasında ayarlayın.
   Set binning ve F / örnek beklenen parlaklık dayalı duracaktır.
   Sadece belirli dalga boylarında ışık elde etmek için planlama sürece, açmak için blok ve filtre emisyon filtre uyarma ayarlayın. DLIT 3D anayasa durumda, farklı dalga boylarında birden fazla emisyon kaynağı doğru lokalizasyon izin filtreleri ayarlayabilirsiniz.
   Fare ya da hayvan bölgeye yansıması sayısına göre A'dan D'ye kadar FOV ayarlayın. 4-5 fareler için 1 fare, C ve D 2-3 fareler için A ve B seçin.
4. Resim Sihirbazı, Kazanç Kontrol Paneli sıra kurulum eklemek için ekle düğmesine tıklayın.
5. Elde tıklayarak görüntüleme sırası başlayın.
   DLIT 3D inşaat halinde, Işıklı görüntüler, farklı dalga boylarında birden fazla emisyon filtreler için alınacaktır. Fotografik ve yapılandırılmış ışık görüntüleri de kazanılmış olacaktır.
6. Satın alma sırasında görüntü ve görüntü seviyeleri paneller düzenlemek görünür olacaktır. Sonraki zamanlarda görüntüleri kolay takibi sağlamak ve görüntüleri kaydetmek için resim düzenleme her bir deney için mümkün olduğunca ayrıntılı bilgi olarak doldurun.
7. IVIS görüntüleme odasının fareler ReRemove ve onları kendi kafeslerine geri. Bir kurtarma dikkatfareler sağlamak için esthesia yordam tarafından önemli ölçüde etkilenmemiştir. Hayvanlar sürekli tam anestezi kurtarmak (genellikle 1-2 dakika) kadar izlenmelidir.

4. ex vivo Görüntüleme ve Akciğerler Bakterilerin Niceleme CFU Analizi

1. Ötenazi hemen önce, görüntüleme için aynı şekilde luciferase intraperitoneal farelere enjekte edilir.
2. Luciferase enjeksiyondan sonra 100 mg / kg pentobarbitol 5 dakika intraperitoneal fareler Euthanize.
3. Steril forseps ve makas kullanılarak steril Petri-yemekleri fareler ve yerden akciğerlere Eksplant.
4. Yeri Petri yemek görüntüleme odasında eksplante organı içeren ve tüm fare için aynı şekilde biyoparlaklık görüntüler elde.
5. Görüntüleme sonra, steril forseps kullanılarak petri eksplante organı kaldırmak ve 1 mL PBS içinde homojenize.
6. Dilüsyonları ve plaka dokusu uygun seçici besiyerleri olun. Homojenize doku yeniden kaplama için gerekli olmalıdır -80 ° C saklanabilir. Alternatif olarak, homojen doku RNA veya DNA ekstraksiyonu qPCR bakteri sayıları ölçmek için kullanılabilir.

5. Lüminesans Görüntüleme Analizi

1. "Yaşayan Görüntüleme Yazılımı" Başlat ve görüntü dosyalarını taramak.
2. Görüntüleri ayarlamak için "Aracı Paleti 'kullanın. Görüntü düzeltme / ayarlar ve ayrı renk ölçekler için min / max filtreleme değiştirmek için tıklayın ayarlayın.
3. Işık şiddetinin ölçülmesi için açılan listesinde ROI araçlarını kullanın. ROI şekli seçin, sayısı ve boyutu. Drag ROI resmin üzerine ilgi bölgeye çerçevesi. Tüm yatırım getirisi aynı boyut ve şekil olduğundan emin olun. Tıklayın yatırım getirisini ölçme ve kaydetme, kopyalama ve / veya nicel veri ihracat.
4. DLIT 3D rekonstrüksiyonlar durumunda, yapısal ışık görüntü de dahil olmak üzere görüntü sırası yükleyin. Platte Aracı yüzey topoğrafyası tıklayın. Açılan listesinde, yüzey topoğrafyasını oluşturmak için yeniden yapılandırma sekmesini tıklatın. Bir yüzey karışıklık sonra pencerede görünecektir.
5. Aracı Platte DLIT 3D rekonstrüksiyon seçin. Açılan listesinde, doku özellikleri ve kaynak spektrumu ayarlamak için Özellikler sekmesini tıklatın. Kas, pek çok koşulda tavsiye edilir. Analiz için dalga boyu seçmek için açılan listesinde, analiz sekmesini tıklatın. Parametre sekmesini tıklatın ve varsayılan değerleri onaylamak veya gerekirse DLIT parametrelerini ayarlamak. 3D analiz başlatmak için Yeniden İnşa sekmesini tıklayın.
6. 3D rekonstrüksiyon bittiğinde, 3D görünümü 3 boyutlu rekonstrüksiyon sonuçları gösterecektir. Foton yoğunluğu, vokseller ve DLIT algoritma parametreleri için analiz verileri görmek için sonuçları sekmesine tıklayın.
7. Kaydet ve / veya 3 boyutlu rekonstrüksiyon analizlerin sonuçları ihracat rakamları ve veri dosyalarının içine.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Bulaşmamış bir fare kontrolü ile birlikte bioluminescent bakteri ile enfekte farelerde biyoparlaklık görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Bioluminescent bakteri ile enfekte farelerde pulmoner akciğerler (Şekil 1) önemli bir sinyal üretir. Lüminesans yoğunluğu içinde toplam akı bir yatırım getirisi (ilgi bölgesi) (Şekil 2) olarak belirlendi. Işık şiddeti için nicel veri sinyal bioluminescent bakteri elde edilir ve negatif kontrol ile karşılaştırıldığında onaylamak için akciğerlere elde edilen bakteri koloni oluşturan birim (CFU) için normalize. Sinyal konumu ve yoğunluğu daha da fare yüzeyinin ¹¹ tomografi lüminesans kaynak DLIT 3D rekonstrüksiyon ile analiz edilebilir. Bu analizler, üretilen bioluminescent sinyal ölçümlerini ve lokalizasyonu izin verir. Işıklı enfekte farelerde kaynağı 3D rekonstrüksiyon sonuçları o ışık fare akciğerler (Şekil 3) elde edilir göstermektedir. Bu lüminesans teyit çıkan fare akciğerlerin ex vivo görüntüleri oldukça yakından yan yana bazı diğer doku ya da organ (Şekil 2C) daha akciğerlere yayılan.

Şekil 1. CBRluc tagged with bioluminescent bakteriler ile pulmoner bulaşmış farelerin Lüminesans görüntüleme. Bulaşmamış kontrolü fare solda ve sağda iki enfekte olmuş fareler vardır. Fareler intratrakeal yolla CBRluc (n = 2) ifade bakteri ile enfekte edildi. Sırt, karın, sol tarafında ve sağ tarafında luciferase enjeksiyondan sonra 10 dakika, 4 pozisyon az 10 dakika lüminesans görüntüleri elde edildi.

Şekil 2. CBRluc ifade bakteri ile enfekte farelerden alınan kantitatif ışık şiddeti (A, B) ROI analizi ve dorsal ve ventral pozisyonda ROI ışık sayısal toplam akı Lüminesans görüntüleri, sırasıyla. Bulaşmamış fareler solda ve sağda iki enfekte olmuş fareler vardır. Akciğerler o Lüminesans görüntüler elde edilmiştirf fareler bulaşmamış CBRlux ile enfekte (n = 2). Akciğerler etrafında ışık yoğunluğu ROI analizi ile belirlendi. C) bulaşmamış (üstte) ve enfekte (alt akciğerlerin iki takım) farelerden alınan akciğerlerin ex vivo görüntüleri. Sonra önce ötanazi ve görüntüleri elde edildi luciferase 5 miniuts enjekte edildi. CFU sayısal değerler normalize edilir.

Şekil 3. Pulmoner enfekte fare biyoparlaklık kaynak (lar) 3D rekonstrüksiyon fare CBRluc intratrakeal enjeksiyon yoluyla ifade bakteri ile enfekte oldu. Görüntü sırası seri 540 nm ila 700 nm dalga boylarında farklı emisyon filtreler kullanılarak elde edilmiştir. Bir görüntü dizisi lüminesans kaynağı için yapılandırılmış bir imag içeren hayvan konularda 3D sulandırıldıktan için kullanılmıştır. A) fare tomografi farklı pozisyonlarda gösterilen: ön, arka, sağ ve sol. Işık kaynakları, yeniden yapılanma tarafından belirlendiği gibi akciğer içinde yer vokseller (3D fare içinde kırmızı kutu) olarak gösterilir. B) ölçülen ve simüle edilmiş veri Foton densiy harita. Ölçülen ve simüle foton yoğunluğu eğrileri yeniden inşa kalitesi bilgi vermek karşılaştırılması. Benzer ölçülen ve simüle foton yoğunlukları kaliteli rekonstrüksiyonlar sonucudur.

Bu protokoller genellikle yüksek kaliteli görüntüler neden olmakla birlikte, bu görüntüleme çalışmalarından elde edilen doğru ve tutarlı verilerin elde etmek için birkaç temel sorunları dikkate almak önemlidir. Lüminesans görüntü sinyali arka plan üzerinde ve kamera doymuş değildir sağlamak için 600 ila 60.000 sayımlar elde edilmelidir. Elde edilen sinyal 600 den az ise maruz kalma koşullarını sayımı artırmak için ayarlanabilir olmalıdır. 60.000 'den fazla elde edilen sinyal ise, bazı bölgelerde kamera doymuş yağlardır. Kamera doymuş, ölçme hala mümkün olmasına rağmen, doymuş bölgelerinde çalıştı ve doymuş olmayan bölgelerde bazen gerekli olmamalıdır. Buna ek olarak, 3 boyutlu rekonstrüksiyon bir bölgelerin yeniden inşası için maske için kullanılan bölgenin içinde yer doymuş zaman doğru olarak yapılmalıdır olamaz. Binning ve F / stop görüntü elde yanı sıra görüntüleme bölge veya hayvan pozisyonda değişiklik ayarı, pozlama süresi elde edilen sinyalin kontrolü ve nicel veri analizi izin. Böylece, pek çok deney görüntüleri en az bir set, kantitatif analiz izin için gerekli sınırlar içinde olacağını sağlamak için birden fazla maruz kalma koşulları altında sürekli görüntü hayvanlar için yararlı olur.

Herhangi bir muhabir gen olduğunu ifade hatırlamak önemlidir, gerekli görüntüleme için kullanılacak rekombinantlar suşları sağlığı üzerindeki potansiyel etkilerini değerlendirmek için pilot çalışmalar yürütmek için virülans etkileyebilir. Bakteri yabancı genlerin ifade gerektirir, çünkü bu bioluminescent görüntüleme sınırlamaları biridir. Bu genellikle birden fazla Işıklı muhabiri sistemleri metabolizması veya muayene etkileri farklı olabilir etkisini azaltmak için, muhabir genlerin ekspresyon düzeyleri titrasyonu incelenecek bakteri türleri için uygun kodon kullanımı optimize yapıları kullanımı yoluyla üstesinden olabilir fitness.

Enfeksiyöz ajanlar ile görüntüleme çalışmaları için bir diğer önemli değişken görüntülü ajan tarafından üretilen sinyal seviyesidir. Her ajan için algılama eşiğini farklılıklar in vitro karşılaştırıldığında gibi hayvanların olduğu için, önce ajan numaraları optimize etmek için birden fazla bulaşıcı dozlarda kullanılarak pilot çalışmalar daha kapsamlı deneyler yürüten önerilir . Bioluminescent gazetecilere kendileri de üretilen sinyal seviyesini mümkün olduğunca yüksek olmasını sağlamak için, transkripsiyon, çeviri ve düşük toksisite için optimize edilmiş olmalıdır. In vitro olarak çoğu durumda gazetecilere optimizasyonu yapılabilir, ancak ışık emisyon dalga boyu da önemli de doğrudan hayvanlarda farklı gazetecilere değerlendirmek için en iyi muhabirleri tarafından üretilen memeli doku nüfuz yeteneği ışık etkileyecektir. Her hayvan, hayvanlar arasında değişkenlik büyük bir anlaşma için kontrol, ayrı ayrı takip edilebilir olsa da, bu gruplar arasında istatistiksel anlamlılık tespit edilmesi için yeterli hayvanlar dahil etmek için hala gereklidir. Genellikle, hayvan sayıları 4 olmalıdır - her grupta 6, gruplar arasında birçok durumda dikkat edilmesi gereken iki kat kadar düşük farklılıklar izin. Son olarak, aşılama uygun dokulara teslim ve kesin ajan numaraları rota ve doğruluğu, hayvanlar arasındaki genel değişkenliği azaltarak tutarlı sonuçlar sağlamaya yardımcı olacaktır.

Üretilen biyoparlaklık spektral özellikleri de in vivo olarak görüntü enfeksiyonlara yeteneğini etkileyen önemli bir faktördür. Memeli dokularında, 600 nm az dalga boylarında ışık, büyük ölçüde, hemoglobin tarafından memeli dokusunun önemli bir bileşeni emilir. Biyoparlaklık dalga boylarında penetrasyon derinliği önemli ölçüde daha uzun dalga boyları için 600 nm ^8,12 artar. CBRluc ve FFluc her ikisi de derin dokulara hatta akciğer ^ve karaciğer 7-8 de dahil olmak üzere, in vivo görüntüleme için bu luciferases neredeyse ideal bir gazetecilere, üzerinde 600 nm de dahil olmak üzere geniş bir dalga boyu, biyoparlaklık üretmek.