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Craniofacial विकास के दौरान बहिर्जनस्तरीय epithelia के संकेतन गुण का आकलन

,

Department of Orthopaedic Surgery, University of California San Francisco

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Cite this Article: Craniofacial विकास के दौरान बहिर्जनस्तरीय epithelia के संकेतन गुण का आकलन

Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development. J. Vis. Exp. (49), e2557, doi:10.3791/2557 (2011).

Abstract: Craniofacial विकास के दौरान बहिर्जनस्तरीय epithelia के संकेतन गुण का आकलन

एवियन भ्रूण की पहुंच में मदद मिली है प्रयोगात्मक embryologists विकास और ऊतक कि बातचीत patterning और रीढ़ की morphogenesis (उदाहरण के लिए, 1, 2, 3, 4) को विनियमित करने की भूमिका के दौरान कोशिकाओं के भाग्य को समझते हैं. यहाँ, हम एक तरीका है कि इस पहुंच का लाभ उठाते चेहरे विकास के दौरान संकेतन और बहिर्जनस्तरीय ऊतकों के patterning के गुणों का परीक्षण वर्णन. इन प्रयोगों में, हम सतह मस्तक का बाह्य त्वक स्तर है कि या तो एक ही क्षेत्र या लड़की भ्रूण की एक अस्थानिक क्षेत्र पर बटेर या माउस से ऊपरी जबड़े शामिल रोपाई से 5 बटेर - लड़की या माउस लड़की 6 chimeras बनाएँ. दाता ऊतक के रूप में बटेर की लड़कियों में प्रत्यारोपण के लिए उपयोग करने के लिए एक nucleolar बटेर में मौजूद कोशिकाओं लेकिन लड़की नहीं मार्कर का लाभ ले, इस प्रकार जांचकर्ताओं मेजबान और दाता ऊतकों 7 भेद करने के लिए अनुमति देता है विकसित किया गया था. इसी तरह, एक दोहराव तत्व माउस जीनोम में मौजूद है और सर्वत्र व्यक्त है, जो हमें लड़की माउस 8 chimeras में मेजबान और दाता के ऊतकों को भेद करने के लिए अनुमति देता है. दाता ऊतक के रूप में माउस बाह्य त्वक स्तर का उपयोग बहुत इन ऊतकों बातचीत की हमारी समझ का विस्तार होगा, क्योंकि यह हमें परीक्षण करने के लिए बाह्य त्वक स्तर के संकेत गुणों विभिन्न उत्परिवर्ती भ्रूण से निकाली गई की अनुमति देगा.

Protocol: Craniofacial विकास के दौरान बहिर्जनस्तरीय epithelia के संकेतन गुण का आकलन

1. दाता ऊतक की तैयारी

  1. संस्कृति मीडिया तैयार, कांच पिन पैनापन, टंगस्टन सुइयों पैनापन.
  2. खोल से भ्रूण ले लीजिए, बर्फ की ठंड पीबीएस में धो लो.
    1. 10 एमएल सिरिंज और एक 18 गेज सुई का प्रयोग अंडा खोल के अंत बताया से albumin का 1.0 एमएल हटायें.
    2. कैंची की बात का उपयोग कर खोल के शीर्ष पर एक छोटे से छेद करें, और तब भ्रूण को बेनकाब करने के लिए एक परिपत्र खोलने में कटौती
  3. DMEM (सीरम मुक्त, कमरे के तापमान) में सिर और जगह निकालें
  4. भ्रूण (या ऐसे दाढ़ की हड्डी या जबड़े प्रक्रिया के रूप में अन्य दाता साइट) से Frontonasal प्रक्रिया का काटना
  5. डाइजेस्ट में 20mins के लिए बर्फ पर 2.4U / एमएल पीबीएस में dispase
  6. 1% BSA पाचन को रोकने के साथ DMEM साथ ऊतकों को कवर
  7. अलग बाह्य त्वक स्तर, mesenchyme, और neuroectoderm तेज टंगस्टन सुई का प्रयोग करें
  8. जब तक मेजबान प्रत्यारोपण के लिए तैयार है DMEM बर्फ पर 1% BSA में भ्रष्टाचार ऊतक स्टोर

2. होस्ट तैयारी

  1. भ्रूण बेनकाब
    1. 10 एमएल सिरिंज और एक 18 गेज सुई का प्रयोग अंडा खोल के अंत बताया से albumin का 1.0 एमएल हटायें.
    2. कैंची की बात का उपयोग कर खोल के शीर्ष पर एक छोटा सा छेद बनाओ. छेद पर टेप का एक टुकड़ा प्लेस, और फिर भ्रूण को बेनकाब करने के लिए एक परिपत्र खोलने में कटौती.
  2. संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, amnion समझ और धीरे एक छेद बनाने के आंसू हैं.
  3. सही नज़र पर संदंश की एक जोड़ी रखने और दबाव लागू करने से सिर घुमाएँ. जबकि सिर स्थिर पकड़े, एक टंगस्टन सुई का उपयोग करने के लिए मेजबान बाह्य त्वक स्तर को दूर करने के लिए भ्रष्टाचार को समायोजित.
  4. भ्रष्टाचार को एक गिलास विंदुक मेजबान का उपयोग करने के लिए स्थानांतरण.
  5. स्थिति भ्रष्टाचार को हटाया बाह्य त्वक स्तर की जगह है. Grafted ऊतक जगह में भ्रष्टाचार पिन के प्रत्येक कोने में एक गिलास पिन डालें. गिलास पिन करने के एक शराब की लौ से अधिक ठीक एक बिंदु के लिए एक microcapillary ट्यूब खींच.
  6. टेप कसकर छेद पर प्लेस और इनक्यूबेटर करने के लिए विश्लेषण के लिए समय की उचित लंबाई के लिए भ्रूण वापसी.
  7. इन्हें भी देखें: 9

3. प्रतिनिधि परिणाम:

Chimeras का आकलन करने के लिए, भ्रूण और एकत्र किया जाना चाहिए मेजबान और दाता ऊतकों के वितरण का विश्लेषण के लिए कार्रवाई की. बटेर कोशिकाओं, immunohistochemistry QcPN एंटीबॉडी का उपयोग का पता लगाने के लिए (में वर्णित: 3) कार्यरत है, और 6 माउस कोशिकाओं के आयल वर्गों पर स्वस्थानी संकरण में पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. दाता कोशिकाओं उपकला को प्रतिबंधित किया जाना चाहिए, और वहाँ दाता mesenchymal ऊतकों के कोई सबूत नहीं है (चित्रा 1) होना चाहिए. mesenchyme में अलग दाता कोशिकाओं की उपस्थिति संदूषण तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की उपस्थिति है जो किसी भी रूपात्मक चेहरे विकास के कई पहलुओं (जैसे, 10) पर इन कोशिकाओं के प्रभाव की वजह से व्याख्या उलझाना होगा इंगित करता है. एक बार आश्वस्त है कि भ्रष्टाचार तकनीक mesenchyme contaminating से मुक्त है, आगे रूपात्मक या आणविक परिणाम उपाय करने के लिए chimeras का आकलन किया जा सकता है. हमारे प्रयोजनों के लिए, हम अस्थानिक cartilages और हड्डियों कि ऊपरी जबड़े के duplications कि प्रतिरोपित ऊतकों (चित्रा 2), और grafted बाह्य त्वक स्तर के जवाब में mesenchymal ऊतकों में आणविक परिवर्तन द्वारा प्रेरित किया गया (चित्रा 3) के लिए corresponded की उपस्थिति का पता चला 5,6.

चित्रा 1
चित्रा 1. Chimerism का मूल्यांकन (ए) धुंधला एंटी QcPN बटेर - लड़की chimeras में बटेर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. Mesenchyme में धुंधला के कोई सबूत नहीं है. (बी) स्वस्थानी संकरण में माउस लड़की chimeras में साइन B2 टेप की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. अभिव्यक्ति भ्रष्टाचार जिसमें बाह्य त्वक स्तर के लिए प्रतिबंधित है.

चित्रा 2
चित्रा 2 Trichrome धुंधला ऊपरी जबड़े कंकाल की (ए) बटेर लड़की कल्पना में दोहराव, और (ख) माउस लड़की chimeras से पता चलता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. बाह्य त्वक स्तर mesenchyme में जीन की अभिव्यक्ति regultes है . (ए) एक लड़की भ्रूण की mesenchyme में सामान्य Bmp7 अभिव्यक्ति (Adobe Photoshop में सकारात्मक संकेत छद्म रंग लाल के साथ स्वस्थानी संकरण में रेडियोधर्मी) . (बी) Bmp7 अभिव्यक्ति chimeric भ्रूण में भ्रष्टाचार (एरो) के निकट mesenchyme में प्रेरित है.

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Discussion: Craniofacial विकास के दौरान बहिर्जनस्तरीय epithelia के संकेतन गुण का आकलन

इस प्रत्यारोपण पद्धति का उपयोग करके हमें निर्धारित करने के लिए कि बाह्य त्वक स्तर संकेत जानकारी है कि dorsoventral polarity और ऊपरी जबड़े के proximodistal विस्तार को नियंत्रित करने के लिए अनुमति दी गई है. जब बटेर या माउस बाह्य त्वक स्तर, और कई प्रजातियों 6,11 के बीच इस ऊतक में आणविक संकेतों के संरक्षण का उपयोग कर परिणामों की समानता इंगित करता है कि यह रीढ़ के बीच एक उच्च संरक्षित संकेतन केंद्र है. इसके अलावा, अन्य जांचकर्ताओं को इसी तरह की तकनीक का इस्तेमाल किया है सतह मस्तक का बाह्य त्वक स्तर के विभिन्न क्षेत्रों के संकेत गुणों का परीक्षण किया है और कई संकेत बाह्य त्वक स्तर में स्थित है कि 12 चेहरे के morphogenesis योगदान केन्द्रों की उपस्थिति में खुला. इस विधि हमें भूमिका की है कि विभिन्न ऊतकों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतकों के भीतर क्षेत्रीय मतभेद, चेहरे की विकास के दौरान खेलने की हमारी समझ को आगे करने के लिए अनुमति देता है. अंत में, एवियन - कल्पना प्रणाली की ताकत के साथ माउस आनुवंशिकी की शक्ति के संयोजन से हम विकास के दौरान उपकला-mesenchymal बातचीत के आणविक मध्यस्थों स्पष्ट करने में सक्षम हो सकता है, और हम तंत्र है जिसके द्वारा इन संबंधों को विनियमित की पहचान करने में सक्षम हो जाएगा विकास.

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Disclosures: Craniofacial विकास के दौरान बहिर्जनस्तरीय epithelia के संकेतन गुण का आकलन

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: Craniofacial विकास के दौरान बहिर्जनस्तरीय epithelia के संकेतन गुण का आकलन

यह काम R01-DE018234 और R01-DE019638 द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials: Craniofacial विकास के दौरान बहिर्जनस्तरीय epithelia के संकेतन गुण का आकलन

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Tektronix, Inc. TEKZR114
DMEM University of California - San Francisco CCFDA003
BSA Sigma-Aldrich A7906
Dispase GIBCO, by Life Technologies 17105-041
35x10 mm Petri dish Falcon BD 1008
No. 5 Dumont forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 14058-11
Spring Scissors Fine Science Tools 15010-11
Needle holder Fine Science Tools 26016-12
Tungsten Needle Fine Science Tools 26000
Microcapillary tube Drummond Scientific 3-000-225-G
Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-6B
Spring scissors Fine Science Tools 15010-11
Blade holder Fine Science Tools 10052-11
Razor blade Fine Science Tools 10050-00

References: Craniofacial विकास के दौरान बहिर्जनस्तरीय epithelia के संकेतन गुण का आकलन

  1. Noden, D. M., The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues. Developmental Biology 96, 144 (1983).
  2. Bronner-Fraser, M. and Stern, C., Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration. Developmental Biology 143, 213 (1991).
  3. Schneider, R. A., Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton. Developmental Biology 208 (2), 441 (1999).
  4. Couly, G. et al., Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head. Development 129 (4), 1061 (2002); Evans, D. J. and Noden, D. M., Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells. Dev Dyn (2006).
  5. Hu, D., Marcucio, R., and Helms, J. A., A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development 130 (9), 1749 (2003).
  6. Hu, D. and Marcucio, R. S., Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Dev Biol 325 (1), 200 (2009).
  7. Lièvre, C. S. Le and Douarin, N. M. Le, Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology 34 (1), 125 (1975); Noden, D. M., An analysis of migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev Biol 42 (1), 106 (1975).
  8. Bollag, R. J. et al., Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras. Exp Cell Res 248 (1), 75 (1999).
  9. Korn, M. J. and Cramer, K. S., Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp (8), 306 (2007).
  10. Eames, B. F. and Schneider, R. A., Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development. Development 132 (7), 1499 (2005).
  11. Odent, S. et al., Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly. Hum Mol Genet 8 (9), 1683 (1999).
  12. Szabo-Rogers, H. L. et al., Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit. Development 136 (2), 219 (2009).

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