تعديل ES / OP9 المشارك الثقافة ينص البروتوكول خصائص محسنة من النسل للدم

Lynch, M. R., Gasson, J. C., Paz, H. Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny. J. Vis. Exp. (52), e2559, doi:10.3791/2559 (2011).

وتمايز الخلايا في المختبر من أجل التوصل إلى وفاق مصير الخلايا المكونة للدم ومفيدة عند دراسة السكان الخلية التي يصعب الوصول إليها في الجسم الحي والتي تتميز عن أقرب الجينات المسؤولة عن تكون الدم ، دون الاضطرار إلى التعامل مع lethalities الجنينية. وقد صممت في الأصل المشترك ES/OP9 ثقافة النظام لإنتاج الذرية المكونة للدم ، من دون إنتاج أكثر من الضامة ، كما هو اشتقاق خلايا انسجة OP9 خط من calvaria تصخر العظم من الفئران الطافرة التي تفتقر الوظيفية M - CSF. يمكن استخدام النظام في المختبر المشترك ES/OP9 الثقافة من أجل التنمية ألخص للدم في وقت مبكر. عندما مثقف على OP9 الخلايا اللحمية والخلايا ES تفرق في hemangioblasts + Flk - 1 ، أسلاف المكونة للدم ، وتنضج في النهاية ، الأنساب المتباينة عضال. المعيار المشترك ES/OP9 ثقافة يستتبع بروتوكول موضع وفاق على خلايا طبقة متموجة من OP9 الخلايا ، وكذلك دورية replating الخطوات من أجل إزالة القديمة ، وتلويث OP9 الخلايا. وعلاوة على ذلك ، والبروتوكولات الحالية تنطوي على تقييم فقط على الخلايا المكونة للدم وجدت في تعليق وليست الأمثل لتقييم ES - مشتقة ذرية في كل يوم من التمايز. ومع ذلك ، مع الخطوات replating وحصاد الخلايا تعليق واحد فقط من المحتمل يفتقد جزء كبير من وفاق المستمدة من سلالة الخلايا المكونة للدم والبلدان النامية. هذه المسألة هامة للتصدي ليصبح عند محاولة توصيف للدم العيوب المرتبطة بخطوط ES خروج المغلوب. نحن هنا وصف تعديل ES / mStrawberry OP9 شارك في الثقافة ، والذي يسمح للقضاء على الخلايا من تلويث OP9 المقايسات المصب. هذا الأسلوب يسمح للتقييم الشامل لجميع ذرية ES - مشتقة في جميع أيام الثقافة المشتركة ، مما أسفر عن نمط التمييز المكونة للدم ، والذي يتوافق بشكل مباشر للنمط التمايز للدم لاحظ داخل الجنين.

1. إعداد الخلايا ES

1. خلايا ES الثقافة وفقا لبروتوكول موحد لخطك خلية معينة. تأكد من أن تعد وفاق خلايا كافية لوحة على الخلايا OP9 mStrawberry لليوم 0 (سيتم مطلي خلايا ES 1x10 في الخلايا لكل سم 3 ^ ² في يوم 0)

2. إعداد OP9 الخلايا

1. قبل تنامي الخلايا OP9 mStrawberry ، وإعداد وسائط النمو OP9
   OP - 9 الثقافة خلية متوسطة
   

   	الأوراق المالية	اضرب النهائي.	الحجم (مل)
   aMEM			39.5
   FBS (OP - 9 اختبار)	100 ٪	20 ٪	10
   L - الجلوتامين	100X (200MM)	2mm و	0.5
   			50mL

   
   مخزن عند 4 درجة مئوية ، واستخدام في غضون أسبوع من التحضير
2. من أجل الحفاظ على mStrawberry OP9 الخلايا ، يجب تغيير وسائل الاعلام كل يوم 2 وينبغي subcultured الخلايا قبل الوصول إلى الخلايا confluency (ثقافة فرعية في 70-90 ٪ confluency). ونمت أبدا الثقافات mStrawberry الخلية OP9 تتجاوز 90 ٪ confluency لأن هذا سيؤدي بهم إلى التمايز في الخلايا الشحمية. انظر الشكل 3.
   1. ثقافة فرعية الخلايا خلايا غسل 2X مع برنامج تلفزيوني (أو مع 1X PBS + 0.1 ٪ مع التربسين 1X - EDTA)
   2. إضافة قبل تحسنت بنسبة 0.1 ٪ التربسين - EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (أو حتى فصل الخلايا)
   3. عندما يكون فصل الخلايا ، إضافة OP - 9 المتوسطة النمو. نقل الخلايا إلى أنبوب 50mL المخروطية.
   4. خلايا بيليه في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف.
   5. Resuspend خلايا جديدة في وسائط النمو mStrawberry OP9
   6. لوحة خلايا في مناطق ذات كثافة أدنى من الخلايا ⁴ 10 / سم ²
   7. تنمو الخلايا لmStrawberry OP9 confluency اعتبارا من 3 أيام قبل يوم اللازمة للخلايا ES شارك في زراعة (اليوم 0 ، يوم 5 أو Day8 / 9 من التجربة)

3. ES / mStrawberry OP9 المشارك الثقافة

1. إعداد وسائل الاعلام التفريق المشارك الثقافة
   

   	الأوراق المالية	نهائي	الحجم (مل)
   aMEM			39.5
   FBS	100 ٪	20 ٪	10
   L - الجلوتامين	200MM	2mm و	0.5
   			50mL

2. mStrawberry OP9 الخلايا (اليوم -3)
   1. ثقافة ثانوية دائما OP9 -3 خلايا في اليوم ، بحيث يكون لديك طبقات من الخلايا متموجة OP9 mStrawberry ل 0 يوم الثقافة المشتركة. انظر الشكل 4B. لوحة mStrawberry OP9 الخلايا في 1x10 ⁴ / سم ² للconfluency في اليوم 0. تأكد من خلايا فرعية اضافية لليوم 5 ويوم 09/08 لاستمرار ثقافة المشترك.
3. ES / mStrawberry OP9 شارك في انشاء ثقافة (يوم 0)
   1. غسل خلايا ES 2X مع برنامج تلفزيوني
   2. يعرض للتريبسين الخلايا وفاق مع 0.25 ٪ قبل تحسنت التربسين - EDTA ، يحضن لمدة 37 درجة مئوية @ 5min
   3. إضافة الوسائط تمايز الثقافة المشارك للخلايا
   4. بيليه الخلايا ES في 400xg ، 5 - 7min ، RT. تجاهل طاف
   5. Resuspend الخلايا في التمايز وسائل الاعلام المشارك الثقافة
   6. إزالة وسائل الاعلام من الخلايا OP9 mStrawberry
   7. إضافة الوسائط تمايز المشارك الثقافة قوارير OP9 mStrawberry
   8. لوحة خلايا ES 1x10 ³ / سم ² إلى قارورة من الخلايا OP9 mStrawberry. احتضان خلايا عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ مع الرطوبة.
4. mStrawberry OP9 الخلايا (يوم 2)
   1. mStrawberry OP9 فرعية بحيث يكون لديك طبقات من الخلايا متموجة OP9 mStrawberry ليوم 5 من الثقافة المشتركة. لوحة mStrawberry OP9 الخلايا في 1x10 ⁴ / سم ² للconfluency في يوم 5 (كما في الخطوة 3.2). تأكد من خلايا فرعية اضافية ليوم 8 / 9 ، إذا لزم الأمر (كما في الخطوة 2.2).
5. ES / mStrawberry OP9 المشترك الثقافة (اليوم 3)
   1. إزالة بعناية متوسطة من الثقافة المشتركة واستبدال الطازجة متوسطة التمايز المشارك الثقافة

6. ES / mStrawberry OP9 المشترك الثقافة (يوم 5)

   1. تغسل بعناية شارك في برنامج تلفزيوني مع الثقافات 2X
   2. يعرض للتريبسين الخلايا مع 0.25 ٪ قبل تحسنت التربسين - EDTA
   3. قارورة غسل الخلايا قبالة مع وسائل الاعلام التفريق المشارك الثقافة
   4. بيليه في الخلايا 400xg ، 7min ، RT. تجاهل طاف
   5. إضافة الوسائط تمايز الثقافة المشارك للخلايا. استخدام إبرة عيار 21 bluntended resuspend إلى الخلايا ، وضمان لتعليق خلية واحدة
   6. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. يجب أن يكون 100-150 أضعاف زيادة في عدد الخلايا ES من اليوم 0.
   7. إعادة البذور 6.48x10 ⁴ / سم ² -- 7.76x10 ⁴ / سم ² المشترك لثقافة الخلايا في طبقة جديدة من متموجة ، وخلايا OP9 mStrawberry
   8. اليوم 5 - المقايسات المتبقية يمكن استخدام المشترك لتحليل الخلايا الثقافة التدفق الخلوي ، cytopreps (30K الخلايا) ، المقايسات رقاقة ، الخ.
7. ES / mStrawberry OP9 المشترك الثقافة (يوم 09/08 ويوم 12)
   1. إزالة التفرقة وسائل الاعلام من القارورة وحفظها. غسل المونولاير مع 1X PBS لإزالة الخلايا المكونة للدم في التعليق. لا طرد الخلايا المكونة للدم.
   2. يعرض للتريبسين الخلايا الملتصقة مع 0.25 ٪ قبل تحسنت التربسين - EDTA
   3. قارورة غسل الخلايا قبالة مع وسائل الاعلام وفاق وتمايز الخلايا المكونة للدم إضافة إلى العثور عليها في تعليق =
   4. بيليه في الخلايا 400xg ، 7min ، RT. تجاهل طاف
   5. إضافة المشارك ثقافة الإعلام تمايز أو برنامج تلفزيوني إلى الخلايا. استخدام إبرة عيار 21 bluntended resuspend إلى الخلايا وحيدة لضمان لعدد الخلايا الخلية تعليق باستخدام عدادة الكريات.
   6. لا يمكن أن تستمر المشاركة في الثقافة لمدة 14 يوما لتقييم الأسلاف لدم أكثر نضجا من قبل خلايا شارك في ثقافة إعادة البذر على طبقة جديدة من متموجة ، وخلايا OP9 mStrawberry في يوم 8 أو 9 و ثم مرة أخرى في يوم 12. إعادة البذور المحسنة عدد الخلايا على أساس استرداد الخلية المطلوبة ليوم الفحص.
8. تقييم ES المستمدة من سلالة (يوم 14/01). ويمكن تقييم ES - مشتقة ذرية في أي يوم من الثقافة المشتركة التي تدفق فرز الخلايا السلبية mStrawberry (ES - مشتقة النسل).
   1. إزالة التفرقة وسائل الاعلام من القارورة وحفظها. غسل المونولاير مع 1X PBS لإزالة الخلايا المكونة للدم في التعليق. لا إرم من الخلايا المكونة للدم.
   2. يعرض للتريبسين الخلايا الملتصقة مع 0.25 ٪ قبل تحسنت التربسين - EDTA
   3. قارورة غسل الخلايا قبالة مع وسائل الاعلام التفريق المشارك ثقافة وإضافة إلى الخلايا المكونة للدم وجدت في تعليق
   4. بيليه في الخلايا 400xg ، 7min ، RT. تجاهل طاف
   5. Resuspend الخلايا مع عيار 21 إبرة bluntended والعد
   6. يمكن ذرية ES - مشتقة (الخلايا السلبية mStrawberry) يكون تدفق فرزها من الخلايا mStrawberry OP9 إيجابية. ويمكن عندئذ ذرية ES - مشتقة يتسم تحليل التدفق الخلوي ، cytopreps ، المقايسات رقاقة ، الخ.

4. ممثل النتائج :

الشكل 1. ES / mStrawberry OP9 المشارك ثقافة النظام. مختبر لدينا يستخدم في المختبر ES نظام المشاركة في زراعة الخلايا المكونة للدم لنموذج التنمية. في هذا النظام المشترك والثقافة ، وخلايا ES يفرق ، في hemangioblasts في Day5 ، عند وضعه على طبقة من الخلايا متموجة OP9 mStrawberry. كما شارك في العائدات والثقافة ، والسلائف للدم موجودة في يوم 8 ، في حين الأنساب المتباينة للدم عضال تظهر قبل يوم 14. تشير الأسهم يوما من تمايز عند الركض من ES - مشتقة ذرية على طبقات جديدة من الخلايا متموجة OP9 mStrawberry في الضرورة.

الشكل 2. تمايز الخلايا السليمة وفاق. هي خلايا ES المصنفة على طبقة من mStrawberry OP9 متكدسة في اليوم 0. ES - مشتقة تبدأ ذرية لتصبح مرئية في يوم 3 من التمايز ، مع وفاق المستمدة من سلالة تبدو وكأنها كتلة من الخلايا مع حدود محددة أو بداية لتشكيل نمط دوارة. ينبغي Hemangioblasts ، والتي هي مشتركة تمهيدا لأرومية متوسطة الأنساب البطانية والمكونة للدم ، كما تظهر تراكمت جدلات من الخلايا في يوم 5. لاشتراكهما في الثقافة فترات أطول من خمسة أيام ، ينبغي ES - مشتقة ذرية تظهر مجموعات من الخلايا المكونة للدم. سنتين إلى أربع مجموعات الخلية ، في يوم 6 / 7 ، ينبغي أن تظهر وتنمو في مجموعات أكبر خلية يوم 09/08 من الثقافة المشتركة. كما تم العثور على سلالة أخرى مشتقة ES بإحكام إلى طبقة الخلايا اللحمية ملتصقة.

الشكل 3. غير ناجحة تمايز الخلايا ES النتائج من هذه الثقافة المشتركة تعكس سوء تمايز الخلايا ES. لاحظ كيف ذرية ES - مشتقة لا تظهر في نمط دوارة في اليوم 5. لعدم وجود خلايا في نمط دوارة يشير تشكيل أرومة وعائية غير لائق. إذا أرومة وعائية لا تتطور بشكل صحيح ، ثم واصل المشاركة في الثقافة سيؤدي إلى توقف تمايز النسب المكونة للدم. يجب التخلص من التعاون مع الثقافات تشكيل أرومة وعائية غير لائق.

الشكل 4. mStrawberry الثقافات الخلية OP9 (A) هي subcultured mStrawberry OP9 في الخلية70-90 ٪ confluency. (B) للحصول على التمييز الصحيح ، وتوضع الخلايا وآله وفاق وفاق المستمدة متكدسة على طبقة من الخلايا بشكل مفرط OP9 mStrawberry.

الشكل 5. ممثل ES / mStrawberry OP9 ملف تدفق المشارك ثقافة جميع ذرية ES - مشتقة من خلايا mStrawberry السلبية ، ويمكن فرزها من تدفق الخلايا OP9 mStrawberry. تم تحديد mStrawberry بوابة الخلية السلبية باستخدام ES/OP9 التقليدية المشترك الثقافة.

تمايز الخلايا السليمة ES متكدسة على طبقة من الخلايا OP9 mStrawberry النتائج في إنتاج hemangioblasts + Flk1 في يوم 5 من الثقافة المشتركة. وينبغي أن تظهر Hemangioblasts مكدسة ما يصل جدلات من الخلايا ، كما لوحظ في الشكل 1. للفترة المتبقية من الثقافة المشتركة ، وينبغي مرئية ES - مشتقة ذرية تظهر مجموعات من الخلايا المكونة للدم (الشكل 1). في 7 / Day6 ينبغي كتل الخلية 2-4 تظهر وتنمو في مجموعات أكبر خلية (على حد سواء وملتصقة في التعليق) من يوم 09/08 من الثقافة المشتركة. كما تم العثور على سلالة أخرى مشتقة ES بإحكام داخل طبقة الخلايا اللحمية ملتصقة.

وإن لم تكن مدرجة في البروتوكول ، من الأهمية بمكان قبل اختبار FBS المستخدمة في وفاق متوسط ​​النمو ، والنمو OP9 mStrawberry سائل الإعلام وفاق / mStrawberry وسائل الاعلام التفريق OP9. اختبار المصل بشكل صحيح وينبغي ضمان النمو السليم لخلايا OP9 mStrawberry ، وكذلك ، والتمايز للخلايا السليمة وفاق في الثقافة المشتركة حتى يوم 5 من التمايز. كبديل أو بالإضافة إلى خلايا OP9 mStrawberry ، يمكن المشع OP9 الخلايا ، في 8000 راد ، قبل البذر في confluency (7.8x10 ⁴ خلايا / سم ^2). تشعيع الخلايا OP9 يسمح للقضاء على تكرار الخطوات replating ، وكذلك ، ويسمح للقضاء التام تقريبا من العمر ، وتلويث OP9 الخلايا من المقايسات المصب.

وكانت المهندسة OP9 الخلايا في التعبير عن بروتين mStrawberry بواسطة transducing OP9 الخلايا مع 3ug/mL من mStrawberry ناقلات lentiviral معربا عن إطار السيطرة على المروج CMV (pRRLsin - CMV النواقل ، UCLA ناقلات الأساسية).

معيار ES/OP9 ثقافة بروتوكولات التعاون يستتبع وضع الخلايا ES في الصعود إلى طبقة الخلايا OP9 متموجة ، وكذلك ، وهي خطوة replating يوم 5 من أجل الحد من العمر ، وتلويث OP9 مرور الخلايا من الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تتم إزالة الخلايا المكونة للدم فقط وجدت في تعليق لتقييم ES - مشتقة ذرية. ومع ذلك ، مع خطوة على حد سواء replating وحصاد الخلايا تعليق واحد فقط من المحتمل يفتقد عددا كبيرا من البلدان النامية وفاق المستمدة من الخلايا المكونة للدم. هذه المسألة هامة للتصدي ليصبح عند محاولة توصيف للدم العيوب المرتبطة بخطوط ES خروج المغلوب. من أجل الالتفاف على هذه المشكلة تستخدم مختبرنا معدلة شارك في الثقافة ، من خلال استخدام mStrawberry ، معربا عن OP9 الخلايا. هذا يؤكد أن يتم نقل جميع ذرية ES لاستمرار التعاون الثقافة في يوم 5 ، وبالنسبة لموسم جني جميع ذرية ES - مشتقة عن المقايسات المصب. هذا التعديل يوفر أدوات مفيدة في تقييم وتوصيف للدم المستمدة من سلالة بشرية وخطوط ES الماوس.

هذا ES - mStrawberry OP9 يلخص نموذج التعاون ثقافة مختلف مراحل بدائية ونهائية تكون الدم. في دراسة المراحل الأولى من التنمية للدم ، كثير من الناس استخدام BL - CFC (مثل انفجار الخلية تشكيل مستعمرة) الفحص ، التي تقيم في تطوير أرومة وعائية من الخلية ES. في حين أن الفحص BL - CFC هي أداة مفيدة للدم عند التحقيق في التنمية في وقت مبكر ، يسلك mStrawberry - ES شارك في الثقافة أنظمة المرافق زيادة لأنها تسمح لتقييم أرومة وعائية ، وكذلك ، الأنساب للدم مزيد من الكبار.

وقد أظهرت الأعمال السابقة باستخدام OP9/ES التقليدية والبروتوكولات تمايز EB أن هناك عوامل إضافية ربما من الضروري ، مثل overexpression من HoxB4 ، من أجل استخلاص طويلة الأجل إعادة إسكانها الخلايا الجذعية المكونة للدم في المختبر. أعمال إضافية ضرورية لتقييم ما إذا كانت سلبية mStrawberry وفرزها وفاق المستمدة من السكان تحتوي على الخلايا الجذعية المكونة للدم الحقيقي.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نشكر U. Ganapati لإنشاء واختبار خط mStrawberry OP9 الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، ونحن نشكر سعادة Shafifor مساعدتها مع الثقافة المشتركة. معتمد من قبل HP الزمالة من المعهد القومي للقلب والرئة والدم (F31HL087714) (HP). مضمون هذا العمل هو فقط من مسؤولية المؤلف ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد القومي للقلب والرئة والدم أو المعاهد الوطنية للصحة (NIH). يتم اعتماد التدفق الخلوي مرفق الأساسية في جامعة كاليفورنيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (CA - 16042 - 28697 ومنظمة العفو الدولية) ، ومركز السرطان يونسون ، معهد كاليفورنيا للإيدز ، وكلية الطب في جامعة كاليفورنيا.

1. Baron, M. H. Embryonic origins of mammalian hematopoiesis. Exp Hematol 31 (12), 1160 (2003).
2. Baron, M. H. Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation. Exp Hematol 33 (9), 1015 (2005).
3. Baron, M. H., and Fraser, S. T. The specification of early hematopoiesis in the mammal. Curr Opin Hematol 12 (3), 217 (2005).
4. Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., and Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol 85 (6), 645 (2000).
5. Ganapati, U., et al. Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression. Stem Cells 25 (8), 1872 (2007).
6. Hogan, B. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.) (1994).
7. Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., and Wiles, M. V. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol Cell Biol 13 (1), 473 (1993).
8. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol 7 (6), 862 (1995).
9. Nakano, T. Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro. Semin Immunol 7 (3), 197 (1995).
10. Nakano, T. In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis. Int J Hematol 65 (1), 1 (1996).
11. Nakano, T., Kodama, H., and Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science 265 (5175), 1098 (1994).
12. Turksen, K. Embryonic stem cells : methods and protocols. (Humana Press, Totowa, N.J.) (2002).

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.