Ändrad ES / OP9 Co-kultur protokollet ger förbättrad Karakterisering av hematopoetiska Progeny

Lynch, M. R., Gasson, J. C., Paz, H. Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny. J. Vis. Exp. (52), e2559, doi:10.3791/2559 (2011).

In vitro differentiering av ES-celler mot en hematopoietisk cell öde är användbar när man studerar cellpopulationer som är svåra att komma in vivo och för att karakterisera de tidigaste gener involverade i blodbildningen, utan att behöva handskas med embryonala lethalities. Den ES/OP9 co-kultur-systemet utformades ursprungligen för att producera hematopoetisk avkomma, utan över produktionen av makrofager, som OP9 stromaceller cellinje härstammar från den calvaria av osteopetros muterade möss som saknar fungerande M-CSF. In vitro ES/OP9 co-kultur kan användas för att rekapitulera tidiga hematopoetiska utveckling. När odlade på OP9 stromaceller, ES-celler differentierar till FLK-1 + hemangioblasts, hematopoetisk stamceller och slutligen mogna, obotligt differentierade linjerna. Standarden ES/OP9 co-kultur-protokollet innebär placeringen av ES-cellerna på ett sammanhängande lager av OP9 celler, liksom, periodiska nicasiling åtgärder för att ta bort gamla och kontaminerande OP9 celler. Dessutom är dagens protokoll innebär att endast utvärdera de hematopoetiska celler som finns i fjädring och är inte optimerade för utvärdering av ES-derived avkomma vid varje dag av differentiering. Men med nicasiling steg och skörd av endast fjädring celler en missar potentiellt en stor del av ES-derived avkomma och utveckla hematopoetiska celler. Denna fråga blir viktigt att ta upp när man försöker karakterisera hematopoetisk defekter associerade med linjer knockout ES. Här beskriver vi en modifierad ES / mStrawberry OP9 co-kultur, som möjliggör eliminering av förorenande OP9 celler från nedströms analyser. Denna metod möjliggör en fullständig utvärdering av alla ES-derived avkomma alls dagar av co-kultur, vilket resulterar i en hematopoetisk differentiering mönster, som mer direkt motsvarar den hematopoetisk differentiering mönster som observerats inom embryot.

1. Beredning av ES-celler

1. Kultur ES-celler enligt standardprotokoll för din cellinje. Se till att förbereda sig tillräckligt för ES-celler till tallrik på den mStrawberry OP9 celler för dag 0 (kommer ES-celler vara klädd på 1x10 ^ 3 celler per cm ² vid dag 0)

2. Beredning av OP9 celler

1. Innan växande mStrawberry OP9 celler förbereda OP9 tillväxt medier
   OP-9 cellodlingsmedium
   

   	Stock	Final konc.	Volym (ml)
   aMEM			39,5
   FBS (OP-9 testad)	100%	20%	10
   L-glutamin	100X (200mm)	2mm	0,5
   			50mL

   
   Förvaras vid 4 ° C och användas inom en vecka av förberedelser
2. För att upprätthålla mStrawberry OP9 celler, måste medierna bytas var 2 dagar och celler bör odlas innan cellerna når confluency (subkultur på 70-90% confluency). mStrawberry OP9 cellkulturer är aldrig vuxit över 90% confluency eftersom detta kommer att resultera i deras differentiering i adipocyter. Se figur 3.
   1. Subkultur celler genom tvättning celler 2X med PBS (eller 1x med PBS + 1x 0,1% med Trypsin-EDTA)
   2. Lägg förvärmda 0,1% Trypsin-EDTA vid 37 ° C i 5 minuter (eller tills celler lossnar)
   3. När cellerna har lossnat, lägg till OP-9 tillväxt medium. Överför celler till ett 50mL koniska rör.
   4. Pellets celler vid 300 xgi 5 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
   5. Resuspendera cellerna i färska mStrawberry OP9 tillväxt medier
   6. Tavla celler vid en densitet på minst av 10 ⁴ celler / cm ²
   7. Väx mStrawberry OP9 celler till confluency start 3 dagar innan dagen behövs för samarbete odling ES-celler (dag 0, dag 5 eller Day8 / 9 av experimentet)

3. ES / mStrawberry OP9 Co-kulturen

1. Förbered Co-kultur differentiering medier
   

   	Stock	Slutliga	Volym (ml)
   aMEM			39,5
   FBS	100%	20%	10
   L-glutamin	200mm	2mm	0,5
   			50mL

2. mStrawberry OP9 celler (Dag -3)
   1. ALLTID subkultur OP9 celler Dag -3, så att du har konfluenta lager av mStrawberry OP9 celler för dag 0 i co-kultur. Se figur 4b. Tavla mStrawberry OP9 celler vid 1x10 ⁴ / cm ² för confluency vid dag 0. Var noga med att subkultur extra celler för Dag 5 och Dag 8 / 9 för en fortsättning av samarbetet kultur.
3. ES / mStrawberry OP9 co-kultur Set-Up (Dag 0)
   1. Tvätta ES-celler 2x med PBS
   2. Trypsinize ES-celler med förvärmda 0,25% Trypsin-EDTA, inkubera i 5min @ 37 ° C
   3. Lägg till Co-kultur differentiering medier till celler
   4. Pellets ES-celler vid 400xg, 5-7min, RT. Kassera supernatanten
   5. Resuspendera cellerna i Co-kultur differentiering medier
   6. Ta bort materialet från mStrawberry OP9 celler
   7. Lägg till Co-kultur differentiering media för att mStrawberry OP9 kolvar
   8. Tavla 1x10 ³ ES-celler / cm ² till kolv av mStrawberry OP9 celler. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO ₂ med luftfuktighet.
4. mStrawberry OP9 celler (dag 2)
   1. Subkultur mStrawberry OP9 så att du har konfluenta lager av mStrawberry OP9 celler för Dag 5 i co-kultur. Tavla mStrawberry OP9 celler vid 1x10 ⁴ / cm ² för confluency vid Dag 5 (som i steg 3.2). Var noga med att subkultur extra celler för Dag 8 / 9, om det behövs (som i steg 2.2).
5. ES / mStrawberry OP9 co-kultur (Dag 3)
   1. Ta försiktigt bort medium från co-kultur och ersätta med färska Co-kulturen differentiering medelstora

6. ES / mStrawberry OP9 co-kultur (Dag 5)

   1. Tvätta co-kulturer 2x med PBS
   2. Trypsinize celler med förvärmda 0,25% Trypsin-EDTA
   3. Tvätta cellerna bort kolv med Co-kulturen differentiering medier
   4. Pellets celler vid 400xg, 7min, RT. Kassera supernatanten
   5. Lägg till Co-kultur differentiering media till cellerna. Använd en 21-gauge bluntended nål för att resuspendera cellerna och att för enstaka cellsuspensionen
   6. Räkna celler med en hemocytometer. Bör ha 100-150 faldig ökning av ES-celler nummer från dag 0.
   7. Re-seed 6.48x10 ⁴ / cm ² - 7.76x10 ⁴ / cm ² co-kulturen celler på ett nytt lager av konfluenta, mStrawberry OP9 celler
   8. Dag 5 analyser-Övriga kan samarbeta kulturen celler kan användas för flödescytometri analys cytopreps (30K celler), chip-analyser, etc.
7. ES / mStrawberry OP9 co-kultur (Dag 8 / 9 och dag 12)
   1. Ta bort differentiering media från kolv och spara. Tvätta cellslager 1x med PBS för att ta bort hematopoetiska celler i suspension. Gör kasta inte ut hematopoetiska celler.
   2. Trypsinize vidhäftande celler med förvärmda 0,25% Trypsin-EDTA
   3. Tvätta cellerna bort kolv med media ES differentiering och lägga till hematopoetiska celler finns i suspension =
   4. Pellets celler vid 400xg, 7min, RT. Kassera supernatanten
   5. Lägg till Co-kultur differentiering media eller PBS till cellerna. Använd en 21-gauge bluntended nål för att resuspendera cellerna och att för enstaka Räkna cellsuspension celler med hjälp av en hemocytometer.
   6. Co-kulturen kan fortgå i 14 dagar för att utvärdera mer mogna hematopoetisk stamceller genom att åter sådd co-kulturen celler på ett nytt lager av konfluenta, mStrawberry OP9 celler vid dag 8 eller 9 och sedan igen på dag 12. Re-seed optimerad cell nummer baserat på krävs cell återhämtning för dagen i analysen.
8. Utvärdering av ES-derived avkomma (Dag 1-14). ES-derived avkomma kan utvärderas vilken dag som helst co-kultur genom flöde sortera ut mStrawberry negativa celler (ES-härledda avkomma).
   1. Ta bort differentiering media från kolv och spara. Tvätta cellslager 1x med PBS för att ta bort hematopoetiska celler i suspension. Inte kasta ut hematopoetiska celler.
   2. Trypsinize vidhäftande celler med förvärmda 0,25% Trypsin-EDTA
   3. Tvätta cellerna bort kolv med Co-kultur differentiering media och lägga till hematopoetiska celler finns i suspension
   4. Pellets celler vid 400xg, 7min, RT. Kassera supernatanten
   5. Resuspendera celler med 21-gauge bluntended nål och räkna
   6. ES-derived avkomma (mStrawberry negativa celler) kan flöda sorteras från mStrawberry positiva OP9 celler. ES-derived avkomma kan då präglas av flödescytometri analys, cytopreps, chip-analyser, etc.

4. Representativa resultat:

Figur 1. ES / mStrawberry OP9 Co-kultur-systemet. Vårt labb använder ett in vitro-ES-celler co-kultur-systemet för att modellera hematopoetisk utveckling. I detta samarbete kultur-systemet, ES-cellerna differentiera till hemangioblasts på Day5, när de placeras på ett sammanhängande lager av mStrawberry OP9 celler. Som co-kultur intäkter, hematopoetisk prekursorer är närvarande vid Dag 8, medan obotligt differentierade hematopoetiska linjer visas som dag 14. Pilarna anger dagar av differentiering när passaging av ES-derived avkomma till nya konfluenta lager av mStrawberry OP9 celler i nödvändig.

Figur 2. Korrekt ES celldifferentiering. ES-celler är seedade på en sammanhängande lager av mStrawberry OP9 vid dag 0. ES-härledda avkomma börjar bli synliga i Dag 3 av differentiering, med ES-derived avkomma ser ut som ett kluster av celler med en definierad gräns eller börjar att bilda en virvel mönster. Hemangioblasts, som är den gemensamma mesodermal föregångare för endotelceller och hematopoetisk härstamningar, ska visas som staplade upp virvlar av celler vid dag 5. För co-kultur under längre tid än fem dagar, bör ES-derived avkomma visas som kluster av hematopoetiska celler. Två till fyra encelliga kluster, vid Dag 6 / 7, ska dyka upp och växa till större cell kluster av Dag 8 / 9 av co-kultur. Andra ES härrör avkommor finns också hårt bundna till den klibbiga stromal cellager.

Figur 3. Misslyckade ES-cell-differentiering. Resultat från detta samarbete kultur speglar felaktig differentiering ES-celler. Lägg märke till hur ES-derived avkomma inte förekommer i en virvel mönster på Dag 5. Frånvaron av celler i en virvel mönster indikerar felaktig hemangioblast bildas. Om hemangioblast inte utvecklas på rätt sätt, fortsatte sedan samarbetet kulturen kommer att resultera i hämmad hematopoetiska härstamning differentiering. Co-kulturer med felaktig hemangioblast bildning skall kasseras.

Figur 4. mStrawberry OP9 cellkulturer. (A) mStrawberry OP9 cell subkultiveras på70-90% confluency. (B) för korrekt differentiering, är ES-celler och ES-derived avkomma placeras på en alltför sammanhängande lager av mStrawberry OP9 celler.

Figur 5. Representant ES / mStrawberry OP9 Co-kulturen flöde profil. Alla ES-härledda avkomma är mStrawberry negativa celler och kan flöda sorteras från mStrawberry OP9 celler. mStrawberry negativ cell grinden bestämdes med hjälp av en traditionell ES/OP9 co-kultur.

Korrekt differentiering av ES-celler konfluenta lagret av mStrawberry OP9 celler resulterar i produktionen av Flk1 + hemangioblasts vid dag 5 i co-kultur. Hemangioblasts ska visas som staplade upp virvlar av celler, som observerats i figur 1. För resten av co-kultur, synliga ES-derived avkomma visas som kluster av hematopoetiska celler (Figur 1). Vid Dag6 / 7 03:58 cell kluster bör dyka upp och växa till större cell kluster (både anhängare och i suspension) av Dag 8 / 9 av co-kultur. Andra ES härrör avkommor finns också hårt bundna i den klibbiga stromal cellager.

Även om det inte anges i protokollet, är det viktigt att i förväg testa FBS som används i ES tillväxten medium mStrawberry OP9 media tillväxt och ES / mStrawberry OP9 media differentiering. Ordentligt testade serum bör garantera en korrekt tillväxt av mStrawberry OP9 celler, liksom, riktigt differentiering av ES-celler i samarbete kultur tills Dag 5 av differentiering. Som ett alternativ eller komplement till mStrawberry OP9 celler kan OP9 celler bestrålas, på 8000 rads före sådd på confluency (7.8x10 ⁴ celler / cm ^2). Bestrålning av OP9 celler möjliggör eliminering av upprepade nicasiling steg, liksom, gör det möjligt för nästan fullständig eliminering av gamla och kontaminerande OP9 celler från nedströms analyser.

OP9 celler var konstruerad för att uttrycka mStrawberry protein genom transducing OP9 celler med 3ug/mL av en Lentiviral vektor som uttrycker mStrawberry under kontroll av en CMV promotor (pRRLsin-CMV vektor, UCLA vektor kärna).

Standard ES/OP9 co-kultur protokoll medför placeringen av ES-cellerna på ett sammanhängande lager OP9 celler, liksom, en dag 5 nicasiling steg för att minska gamla och kontaminerande OP9 celler från cell passage. Dessutom är bara hematopoetiska celler finns i suspension tas bort för utvärdering av ES-derived avkomma. Men med både ett nicasiling steg och skörd av enbart fjädring celler en missar potentiellt ett stort antal u-ES-derived hematopoetiska celler. Denna fråga blir viktigt att ta upp när man försöker karakterisera hematopoetisk defekter associerade med linjer knockout ES. För att kringgå detta problem vårt laboratorium används en modifierad co-kultur med hjälp av mStrawberry-uttryckande OP9 celler. Detta försäkrar att alla ES avkomma överförs till det fortsatta samarbetet kultur på dag 5, och för skörd av alla ES-derived avkomma för nedströms analyser. Denna förändring ger en bra verktyg vid utvärdering och karakterisering av hematopoetisk avkomma från både mänskliga och mus linjer ES.

Detta ES-mStrawberry OP9 co-kultur-modellen sammanfattas de olika stegen primitiva och slutgiltiga blodbildningen. När man studerar de tidigaste stadierna av hematopoetisk utveckling, många använder BL-CFC (Blast-liknande kolonibildande cell assay), som bedömer utvecklingen av hemangioblast från ES-celler. Medan BL-CFC-analysen är ett användbart verktyg vid utredning av tidiga hematopoetiska utveckling uppvisar mStrawberry-ES co-kultur system ökar nyttan, som möjliggör bedömning av hemangioblast, liksom, mer vuxen hematopoetiska linjerna.

Tidigare arbete med traditionella OP9/ES och EB protokoll differentiering har visat att ytterligare faktorer kanske nödvändiga, såsom överuttryck av HoxB4, för att få fram långsiktiga återinplantering hematopoetiska stamceller in vitro. Ytterligare arbete behövs för att bedöma om mStrawberry negativt, sorterade ES-derived populationer innehåller äkta hematopoetiska stamceller.

Inga intressekonflikter deklareras.

Vi tackar U. Ganapati för upprättande och testning av mStrawberry OP9 cellinje. Dessutom tackar vi H. Shafifor hennes hjälp med co-kultur. HP stöds av ett stipendium från National Heart, Lung, and Blood Institute (F31HL087714) (HP). Innehållet i detta arbete är enbart författarens ansvar och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Heart, Lung, och blod institutet eller National Institutes of Health (NIH). UCLA flödescytometrisystem Core Facility stöds av NIH (CA-16.042 och AI-28.697), den Jonsson Cancer Center, UCLA aids institutet och UCLA School of Medicine.

1. Baron, M. H. Embryonic origins of mammalian hematopoiesis. Exp Hematol 31 (12), 1160 (2003).
2. Baron, M. H. Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation. Exp Hematol 33 (9), 1015 (2005).
3. Baron, M. H., and Fraser, S. T. The specification of early hematopoiesis in the mammal. Curr Opin Hematol 12 (3), 217 (2005).
4. Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., and Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol 85 (6), 645 (2000).
5. Ganapati, U., et al. Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression. Stem Cells 25 (8), 1872 (2007).
6. Hogan, B. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.) (1994).
7. Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., and Wiles, M. V. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol Cell Biol 13 (1), 473 (1993).
8. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol 7 (6), 862 (1995).
9. Nakano, T. Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro. Semin Immunol 7 (3), 197 (1995).
10. Nakano, T. In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis. Int J Hematol 65 (1), 1 (1996).
11. Nakano, T., Kodama, H., and Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science 265 (5175), 1098 (1994).
12. Turksen, K. Embryonic stem cells : methods and protocols. (Humana Press, Totowa, N.J.) (2002).

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.