Organotypic अनुमस्तिष्क संस्कृति: apoptotic चुनौतियां और जांच

Hurtado de Mendoza, T., Balana, B., Slesinger, P. A., Verma, I. M. Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection. J. Vis. Exp. (51), e2564, doi:10.3791/2564 (2011).

Neuronal ऊतक की Organotypic संस्कृतियों पहले +१,९४७ ^1,2 में थे Hogue द्वारा शुरू की है और तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में एक बड़ी सफलता का गठन. तब से, तकनीक और आगे विकसित किया गया था और इस समय वहाँ कई अलग अलग तरीके हैं organotypic संस्कृतियों तैयार है. विधि यहाँ प्रस्तुत Stoppini एट अल द्वारा वर्णित एक से अनुकूलित किया गया था स्लाइस की तैयारी के लिए और Gogolla एट ^अल से धुंधला 3,4 प्रक्रिया के लिए..

इस तकनीक की एक अनूठी विशेषता यह है कि यह आप हिप्पोकैम्पस या उनके मूल संरचना में सेरिबैलम जैसे मस्तिष्क के विभिन्न भागों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, अलग संस्कृतियों में सभी सेलुलर संगठन और neuronal नेटवर्क बाधित कर रहे हैं पर एक बड़ा लाभ प्रदान. सेरिबैलम के मामले में यह और भी अधिक लाभप्रद है क्योंकि यह Purkinje कोशिकाओं के अध्ययन, अत्यंत dissociated प्राथमिक संस्कृति के रूप में प्राप्त करना कठिन अनुमति देता है. इस विधि के लिए इन विट्रो में सेरिबैलम के कुछ विकासात्मक सुविधाओं का अध्ययन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दोनों जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती चूहों में electrophysiological और औषधीय प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

विधि यहाँ वर्णित किया गया था जैसे विकासशील सेरिबैलम में फैस ligand apoptotic उत्तेजनाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन, TUNEL के धुंधला हो जाना का उपयोग करने के लिए apoptotic कोशिका मृत्यु को मापने. यदि TUNEL के धुंधला कोशिका प्रकार Calbindin जैसे विशिष्ट, Purkinje कोशिकाओं के लिए मार्कर के साथ संयुक्त है, यह संभव है के लिए एक सेल की आबादी विशिष्ट तरीके में कोशिका मृत्यु का मूल्यांकन. Calbindin धुंधला हो जाना भी अनुमस्तिष्क संस्कृतियों की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से कार्य करता है.

1. Organotypic अनुमस्तिष्क संस्कृति:

1. सफलतापूर्वक उत्पन्न organotypic अनुमस्तिष्क संस्कृतियों P0-P3 या P8-p12 के बीच चूहों का उपयोग करें. हमारे प्रयोग के लिए हम रेंज P8-p12 में चूहों का इस्तेमाल किया है क्योंकि इस विकास मंच हमारे अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त था.
2. विच्छेदन और संस्कृति के माध्यम तैयार:
   1. मस्तिष्क विच्छेदन और टुकड़ा तैयारी कम सोडियम कृत्रिम मस्तिष्कमेरु (ACSF) द्रव 1mm कैल्शियम क्लोराइड युक्त, 10mm डी - ग्लूकोज, 4mm पोटेशियम क्लोराइड, 5mm मैग्नीशियम क्लोराइड, 26mm सोडियम बिकारबोनिट, 246mM sucrose और phenol लाल समाधान (1:1000) में किया जाता है , 7.3 पीएच. समाधान बाँझ करने के लिए, यह .22 सुक्ष्ममापी फिल्टर और दुकान के माध्यम से 4 डिग्री सेल्सियस फिल्टर
   2. अनुमस्तिष्क स्लाइस 75% न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) ईगल, 25% गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम, 25mm HEPES, 1mm glutamine, 5mg / एमएल ग्लूकोज, पेनिसिलिन (100 यू / एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल) सुसंस्कृत हैं. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर और 4 बजे दुकान ° सी के माध्यम से दो सप्ताह की एक अधिकतम के लिए मध्यम फ़िल्टर.
3. ठंडा ACSF पहले Carbogen (95% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड) नोट के साथ bubbled मध्यम में मस्तिष्क काटना, Carbogen के साथ कि संतृप्ति समाधान के पीएच बदल तो यह लाल से नारंगी बदलाव होगा. विच्छेदन समय की न्यूनतम राशि संभव सावधान किया जा रहा करने के लिए मस्तिष्क संरचना को नुकसान नहीं किया जाना चाहिए.
4. 400 vibratome का उपयोग सुक्ष्ममापी के बाण के समान अनुभागों में मस्तिष्क स्लाइस.
   1. एक धार के साथ एक गोलार्द्ध में एक बाण के समान कटौती, सेरिबैलम के रूप में संभव के रूप में कम कटौती की कोशिश कर, यह टुकड़ा करने की क्रिया के लिए एक फ्लैट सतह प्रदान करेगा. प्रांतस्था ही समर्थन के लिए प्रयोग किया जाता है टुकड़ा करने की क्रिया आसान बनाने के लिए, लेकिन समय के बाद से एक महत्वपूर्ण मुद्दा है इसे और अधिक सुविधाजनक है एक धार के साथ बाहर प्रांतस्था का व्याख्यान चबूतरे वाला आधा काट.
   2. Cyanoacrylate का उपयोग करें (superglue) के लिए धातु vibratome की थाली पर मस्तिष्क की स्थिति को ठीक. यह गोंद जोड़ने से पहले बर्फ पर थाली ठंड और यह अच्छी तरह से फैल ट्यूब के टिप का उपयोग करने के लिए एक पतली चिपकने वाला परत के रूप में महत्वपूर्ण है. यदि वहाँ superglue की एक अतिरिक्त है, यह थाली से अलग जब यह ACSF और नमूना खो जाएगा के साथ संपर्क में आता है.
   3. एक बार मस्तिष्क vibratome थाली से जुड़ा है, पर्याप्त ACSF मीडिया को जोड़ने के लिए मस्तिष्क कवर और प्लेट नीचे बर्फ डाल यह ठंडा रखने.
   4. 400 सुक्ष्ममापी स्लाइस काटें और उन्हें एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक (इसे चौड़ा और स्लाइसें को नुकसान से बचने के लिए टिप कटौती) के साथ 6 अच्छी तरह से एक सेल संस्कृति बर्फ पर ACSF युक्त थाली हस्तांतरण.
   5. दो विदारक माइक्रोस्कोप के तहत इंसुलिन सीरिंज (छोटे व्यास 28 - गेज सुई के साथ सीरिंज) की मदद के साथ सेरिबैलम मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से अलग करें. कुछ स्लाइस superglue किनारों को संलग्न होगा: इस पल इसे हटाने के रूप में यह टुकड़ा की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं की कोशिश है. यह महत्वपूर्ण है यह अनुमस्तिष्क संरचना को नुकसान पहुँचाए बिना सावधानी से करना.
5. 6 अच्छी तरह से 0.4 सुक्ष्ममापी pores के साथ 30mm संस्कृति थाली आवेषण युक्त प्लेटें अनुमस्तिष्क स्लाइस स्थानांतरण. संस्कृति मीडिया के 1 एमएल प्रति डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ ₂ (सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में). था कि कम से कम 2 घंटे के लिए ऊष्मायन द्वारा 37 पर पूर्व वातानुकूलित जोड़ें यकीन है कि वहाँ कोई हवा बुलबुले के नीचे फंस रहे हैं और फिर वे पूरी तरह से बढ़ा कर रहे हैं सुनिश्चित करने के आवेषण के शीर्ष पर और कोई तरल उन्हें कवर है कि अनुमस्तिष्क स्लाइस (डालने के प्रति 1-3) जगह बनाने के मीडिया के शीर्ष पर आवेषण रखें. यदि आवश्यक हो तो मीडिया से अधिक Aspirate. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ ₂ संस्कृति मीडिया हर 2 या 3 दिन बदलते. यह सबसे अच्छा है एक बार में केवल मध्यम के एक हिस्से (उदाहरण साढ़े मात्रा) की जगह है, के बाद से इस्तेमाल किया माध्यम टुकड़ा व्युत्पन्न पौष्टिकता संबंधी कारक है कि सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं.

2. फैस उपचार और अनुमस्तिष्क स्लाइस की धुंधला:

1. Apoptotic चुनौती प्रयोग के लिए, पहली संस्कृति हम 3 इन विट्रो (DIV3) में 5 दिन पर मीडिया को बदलने दिनों के लिए स्लाइस. DIV5 संस्कृतियों में 0.5 फैस agonist एंटीबॉडी Jo2 के μg / एमएल के साथ यह सीधे मीडिया को जोड़ने के क्रम में मीडिया के परिवर्तन के बाद से कोशिका मृत्यु का एक साफ पृष्ठभूमि द्वारा इलाज कर रहे हैं संस्कृतियों में कुछ मृत्यु को उत्पन्न कर सकते हैं. कुओं की त्रैमासिक नियंत्रण के रूप में अनुपचारित छोड़ दिया जाता है.
2. 24 घंटे के बाद आवेषण नीचे चूषण द्वारा मीडिया को दूर. स्लाइस को ठीक करने के लिए, एक बर्फ के ठंडे 4% पीएफए ​​के नीचे एमएल और ऊपर डालने के 1 एमएल जोड़ें. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
3. 10 मिनट के बाद पीएफए ​​हटायें और ठंड पीबीएस के साथ संक्षिप्त धोने.
4. अगले पीबीएस हटाने और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 20% पीबीएस और सेते में बर्फ ठंड मेथनॉल के डालने से ऊपर 1 एमएल नीचे और 1 एमएल जोड़ने.
5. पीबीएस के साथ फिर से धो और नीचे 1 एमएल और permeabilization के लिए 0.5% की पीबीएस में ट्राइटन-X-100 डालने से ऊपर 1 एमएल जोड़ने. 4 में 12 घंटे की एक न्यूनतम के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
6. Permeabilization के बाद, की एक न्यूनतम के लिए पीबीएस में 20% BSA के साथ ब्लॉककमरे के तापमान पर 4 घंटे या 4 में रातोंरात ° सी. इस स्तर पर स्लाइस 4 में कम से कम 3 दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए अवरुद्ध समाधान में रखा जा सकता
7. आदेश में दाग स्लाइस ध्यान से झिल्ली का टुकड़ा काट सम्मिलित अनुमस्तिष्क टुकड़ा से जुड़ी है और यह 24 अच्छी तरह प्लेटें पीबीएस युक्त करने के लिए स्थानांतरण.
8. immunostaining क्रमिक रूप से किया जाता है, पहले एक घंटे और Calbidin एंटीबॉडी के साथ तो रात भर के लिए TUNEL के अभिकर्मक के साथ.
   1. पीबीएस Aspirate और बंद TUNEL के अभिकर्मक प्रत्येक अच्छी तरह यकीन है कि यह टुकड़ा की पूरी सतह शामिल हैं बनाने में 250 μL जोड़ने. अंधेरे में एक घंटे के लिए 37 ° C पर सेते हैं.
   2. एक घंटे के बाद TUNEL के मिश्रण को हटाने और पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए तीन बार धो.
   3. पिछले धोने के बाद, Pbs हटाने और पीबीएस में Calbindin एंटीबॉडी के एक 1 / 1000 कमजोर पड़ने के 250 μL जोड़ने और 4 में रात सेते ° सी के अंधेरे में.
   4. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए तीन बार धो लो.
   5. जोड़ें माध्यमिक एंटीबॉडी के 250 μL पीबीएस और सेते में अंधेरे में कमरे के तापमान पर कम से कम तीन घंटे के लिए 500 / 1 पतला. TUNEL के लिए किट हम इस्तेमाल TMR लाल के साथ लेबल है, इसलिए हमारे Calbindin लिए माध्यमिक एंटीबॉडी Alexa-488 के लिए संयुग्मित है.
   6. पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए तीन बार धो लें और एक गिलास खुर्दबीन एक बढ़ते मीडिया कि DAPI शामिल का उपयोग कर स्लाइड पर स्लाइस माउंट.
   7. एक confocal खुर्दबीन के साथ क्रमश: 488 एनएम और Calbindin और TUNEL के लिए 561 एनएम उत्तेजना wavelenght उपयोग स्लाइस छवि.

3. प्रतिनिधि परिणाम:

इस प्रोटोकॉल के मुख्य चुनौती स्वस्थ अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों उत्पन्न करने में सक्षम हो सकता है, खासकर के बाद से हमारे अंतिम readout कोशिका मृत्यु हो जाएगा है. एक स्वस्थ संस्कृति जहां सेल शरीर परत पारदर्शी है के रूप में प्रकट होता है और आप खुर्दबीन (चित्रा 1) के तहत सेरिबैलम के foliated संरचना को देखने के लिए अनुमति देता है. संस्कृति में कुछ दिनों के बाद स्लाइस पतली और गैर neuronal कोशिकाओं को शुरू टुकड़ा के हाशिये से दूर पलायन मनाया जा सकता है है. अंधेरे दौर (सबसे संभावना मैक्रोफेज) कोशिकाओं, कि संस्कृति में कुछ दिनों के बाद स्लाइस कवर अंततः इन विट्रो (चित्रा ²⁾ 5 में 10-14 दिनों के बाद संख्या में कमी होगी. स्लाइस की व्यवहार्यता के लिए परम प्रमाण Calbindin जैसे विभिन्न सेलुलर, Purkinje कोशिकाओं के लिए मार्करों के लिए दाग है. चित्रा 3 एक प्रतिनिधि कई TUNEL के सकारात्मक नाभिक के साथ Purkinje सेल परत के confocal खुर्दबीन छवि दिखाता है.

यह महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए है कि भले ही कुछ स्लाइस apoptotic प्रोत्साहन प्राप्त वे केवल 24 घंटे के लिए खुल गए थे. यह TUNEL के धुंधला के साथ मर कोशिकाओं में डीएनए विखंडन का पालन करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दी है, लेकिन एक परिभाषित Purkinje सेल परत अभी भी मौजूद थे.

चित्रा 1. DIV2 पर स्वस्थ अनुमस्तिष्क टुकड़ा. इस छवि को पारदर्शी सेल शरीर परत और एक स्वस्थ टुकड़ा में foliated अनुमस्तिष्क संरचना से पता चलता है.

चित्रा 2. 7 DIV पर स्वस्थ अनुमस्तिष्क टुकड़ा इस छवि में हम अभी भी सेरिबैलम और अंधेरे सेल शरीर की उपस्थिति के foliated संरचना का पालन कर सकते हैं.

चित्रा 3. फैस इलाज अनुमस्तिष्क टुकड़ा के प्रतिनिधि छवि यह confocal छवि Calbindin () हरे और apoptotic TUNEL के धुंधला हो जाना (लाल) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के साथ दाग Purkinje कोशिकाओं से पता चलता है. Purkinje कोशिकाओं किसी एकल पंक्ति में प्रकट नहीं होता है, लेकिन कर रहे हैं folium की तरह एक संरचना बनाने संकुल.

इस विधि neuronal organotypic संस्कृतियों के कई संभावित अनुप्रयोगों में से एक का वर्णन करता है और यह हमें जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती अनुमस्तिष्क स्लाइस में apoptotic उत्तेजनाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति दी गई है.

इस प्रयोग का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा लगातार स्वस्थ अनुमस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों उत्पन्न करने में सक्षम होना है. महत्वपूर्ण कारक विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक और कम से कम संभव समय में प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने की क्षमता है, लेकिन एक ही समय में सावधान किया जा रहा नुकसान नहीं स्लाइस. एक अन्य महत्वपूर्ण कारक और संस्कृति मीडिया की तैयारी संरचना है, इन संस्कृतियों बहुत संवेदनशील होते हैं, इसलिए हम मीडिया के कई व्यंजनों और ब्रांडों का परीक्षण किया था. यहां तक ​​कि सीरम या मीडिया के किसी भी अन्य घटकों के विभिन्न बैचों स्लाइस की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है. हम Invitrogen लूत # 480116 से हार्स सीरम के साथ सबसे अच्छा परिणाम मिला है.

एक बार अनुमस्तिष्क स्लाइस उत्पन्न कर रहे हैं एक अनुमस्तिष्क विकास, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, सेल अस्तित्व अकेले या apoptotic उत्तेजनाओं, excitotoxicity या ऑक्सीजन के अभाव के जवाब में अध्ययन कर सकते हैं. तुलनात्मक जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती अनुमस्तिष्क स्लाइस का उपयोग कर पढ़ाई बहुत व्यावहारिक अनुमस्तिष्क समारोह और विकास के कई पहलुओं में किया गया है.

IACUC द्वारा स्थापित नीतियों के अनुसार सभी जानवर काम आयोजित किया गया था. सॉल्क संस्थान एक AAALAC मान्यता प्राप्त सुविधा है.

इस अध्ययन में भाग Ipsen फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था. IMV आण्विक जीवविज्ञान की एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी के प्रोफेसर, और अनुकरणीय लाइफ साइंसेज में इरविन और Joan याकूब चेयर रखती है. इस काम के हिस्से में एनआईएच, Leducq फाउंडेशन, Meriaux फाउंडेशन, एलिसन मेडिकल फाउंडेशन, Ipsen / Biomeasure, Sanofi एवेंटिस, प्रोस्टेट कैंसर फाउंडेशन, और हेमवती और फ्रांसिस सी. बर्गर फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. पीए McKnight तंत्रिका विज्ञान और नशीली दवाओं के सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान (DA019022 R01) के लिए बंदोबस्ती कोष द्वारा वित्त पोषित है. लेखकों मार्क श्मिट को धन्यवाद देना चाहूंगा. ग्राफिक कला जेमी टी. साइमन द्वारा डिजाइन किया गया था है प्रायोजन कृपया Invitrogen द्वारा प्रदान की गई थी.

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5. Beat H. Gähwiler, S.M.T., R. Anne McKinney, Dominique Debanne, and Richard T. Robertson, Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells, edited by Gary Banker and Kimberly Goslin (The MIT Press, Cambridge, 1998), pp. 461-498.

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