Optische beeldvorming van neuronen in de Krab Stomatogastric Ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen

Stein, W., Städele, C., Andras, P. Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes. J. Vis. Exp. (49), e2567, doi:10.3791/2567 (2011).

Voltage-gevoelige kleurstof beeldvorming van neuronen is een belangrijke methode voor het begrijpen van hoe de neuronale netwerken zijn georganiseerd en hoe de gelijktijdige activiteit van de deelnemende neuronen leidt tot het ontstaan ​​van de integrale functionaliteit van het netwerk. Hier presenteren we de methodiek van toepassing van deze techniek om vastgestelde patronen genereren van neuronen in de krab stomatogastric ganglion. Tonen we het laden van deze neuronen met de tl-voltage-gevoelige kleurstof Di-8-ANEPPQ en laten we zien hoe het imago van de activiteit van neuronen kleurstof geladen met behulp van de MiCAM02 hoge snelheid en een hoge resolutie CCD-camera imaging-systeem. Tonen we de analyse van de geregistreerde beeldgegevens met behulp van de BVAna beeldbewerkingssoftware worden geassocieerd met het MiCAM02 imaging systeem. De gelijktijdige voltage-gevoelige kleurstof beeldvorming van de gedetailleerde activiteit van meerdere neuronen in de krab stomatogastric ganglion toegepast tezamen met de traditionele technieken elektrofysiologie (intracellulaire en extracellulaire registraties) opent totaal nieuwe mogelijkheden voor het begrijpen van hoe de centrale patroon generator neurale netwerken werken.

1. Voorbereiding van de Crab Stomatogastric Zenuwstelsel

Volwassen Cancer pagurus L. werden verkregen uit lokale bronnen (Newcastle University, Dove Marine Laboratories) en bewaard in gefilterd, belucht zeewater (10 - 12 ° C). Dieren werden verdoofd door verpakken ze in ijs voor 20 - 40 min. vóór versnijding. We gebruikten geïsoleerde stomatogastric zenuwstelsel (STNS) ^1. De STNS werd vastgepind in een silicone-elastomeer beklede (ELASTOSIL RT-601, Wacker, München, Duitsland) petrischaaltje en continu superfused (7 - 12 ml / min) met een gekoelde fysiologische zoutoplossing (10-13 ° C). Fysiologische zoutoplossing bestond uit (mmol * l-1): NaCl, 440, MgCl _2, 26; CaCl _2, 13, KCl, 11; trisma basis, 10; maleïnezuur, 5. Zoutoplossing werd gehouden bij een constante temperatuur van 11 - 13 ° C en bij pH 7,4 tot 7,6.

De gedetailleerde stappen van de STNS dissectie en preparaat, met inbegrip van de desheathing van de stomatoastric ganglion (STG), worden gepresenteerd in de Jupiter artikel van Guttierez en Grashow ^1. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 ^november 1986 (86/609/EEG). Figuur 1a toont een schematisch diagram van de STNS en Figuur 1B toont een typische desheathed STG heeft zijn neuronen ingericht als een vlakke halve cirkel in het achterste deel van het ganglion.

De petrischaal met de STNS is bevestigd aan de operationele platform van de imaging microscoop (BW51 WI, Olympus, Tokyo, Japan) met boetseerklei. Beide, de microscoop podium en de microscoop gemonteerd op een trilling geïsoleerde tafel (scientifica, Uckfield, VK) om bewegingsartefacten te voorkomen tijdens de optische recording. De motor patronen gegenereerd in de stomatogastric ganglion (STG) worden gecontroleerd met behulp van extracellulaire opnames ^2-4. Dit gebeurt via de volgende stappen:

1. Een vaseline op basis van cilindrische compartiment is opgebouwd rond een deel van de belangrijkste motorische zenuw (LVN) om de zenuw elektrisch isoleren van het bad (dit gebeurt op de dissectie stadium vóór de petrischaal is geplaatst op de operationele platform van de imaging microscoop ).
2. Een van de twee roestvrij stalen draden elektrode wordt geplaatst in dit compartiment, de andere in het bad als een referentie-elektrode.
3. Het differentieel signaal wordt opgenomen, gefilterd en versterkt met een AC differentiële versterker (Univ. Kaiserslautern, Duitsland).
4. De motorische activiteit van het ganglion wordt gecontroleerd met behulp van een oscilloscoop (DL708E, Yokogawa, Tokyo, Japan) en is bovendien geregistreerd met behulp van een data-acquisitie board (CED Power, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, Verenigd Koninkrijk) en de Spike 2 v6.10 software (Electronic Design Cambridge, Cambridge, Verenigd Koninkrijk). Bestanden worden geanalyseerd met behulp van Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Verenigd Koninkrijk).

2. Voorbereiding van de Dye-oplossing

We gebruikten de tl-voltage-gevoelige kleurstof Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) ^5, die een dubbele positieve lading dat de belading van de kleurstof door middel van micro-elektroden vergemakkelijkt door gebruik te maken positieve stroom pulsen is. De kleurstof oplossing dient te worden beschermd tegen licht zo veel mogelijk. De kleurstof oplossing is als volgt bereid:

1. 5 mg van de kleurstof wordt gemengd met 1 ml van de F-127 Pluronic zuur in DMSO (Invitrogen) oplossing.
2. Het plastic flacon met de opgeloste kleurstof is gecentrifugeerd gedurende 20 minuten bij 12.000 rotatie / minuut in een Sigma Reactievaatjes 1-14 (Sigma, Osterode, Duitsland) om grotere kleurstof deeltjes die de micro-elektrode kunnen verstoppen scheiden.
3. Het supernatant (top 200 pi) van de kleurstof oplossing is gescheiden met behulp van een pipet en opgeslagen in een aparte plastic flacon. Beide flacons zijn verpakt in aluminium folie om de blootstelling aan licht te voorkomen.
4. De kleurstof oplossing is bevroren bij -20 ° C.
5. Voor het gebruik van de kleurstof oplossing is gesmolten door het plaatsen van de gesloten en verpakt flacon in warm (25 ° C) water gedurende 10-15 minuten.

3. Kleurstof wordt geladen door intracellulaire injectie met behulp van micro-elektroden Sharp

We gebruikten scherpe micro-elektroden om de neuronen te laden met de kleurstof. Om te controleren of de kleurstof laden gebruiken we de MiCAM02 imaging-systeem (SciMedia, Tokyo, Japan) ^6. De imaging-systeem beschikt over twee CCD-camera's: de HR-camera heeft een grotere sensor chip (6,4 mm x 4,8 mm) een betere ruimtelijke resolutie met de beste temporele resolutie wordt 1,4 ms, de HS camera heeft een kleiner (2,9 mm x 2,1 mm), maar sneller sensor chip waardoor een snellere beeldverwerking met 0,7 ms als zijn beste temporele resolutie. De stappen van de kleurstof belasting zijn als volgt:

1. Micro-elektroden worden getrokken met een P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) elektrode trekker met 10 cm lang, 1 mm buitendiameter glazen buisjes met een gloeidraad (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Duitsland). De elektroden zijn getrokken om een ​​weerstand in de hebbenrange van 25 - 40 MOhm in 3M KCl (voor de juiste trekken parameterinstellingen van de pipet kookboek die door de maker van de elektrode trekker te volgen).
2. De bevroren kleurstof oplossing is gesmolten en een zeer kleine hoeveelheid van het opgezogen in een microfil naald (MicroFil - 34 g, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL, USA) - de opgezogen kleurstof vult ongeveer 2 / 3 ^e van de microfil naald .
3. De kleurstof oplossing in de microfil naald wordt geïnjecteerd in de punt van een micro-elektrode. De micro-elektrode wordt geplaatst in een donkere box voor 15 minuten.
4. De micro-elektrode is opgevuld met 3M KCl-oplossing. De elektrode wordt dan terug geplaatst in een donkere elektrode opbergbox voor een 10-20 minuten aan de kleurstof oplossing toe aan de fijne punt van de elektrode te bereiken door de zuiging van de capillaire kracht die in de micro-elektrode.
5. De kant micro-elektrode wordt geplaatst in een electrode houder en bevestigd op de headstage van de intracellulaire versterker (IA-251a, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA).
6. De intracellulaire versterker is verbonden met de data-acquisitie bord dat een puls signaal om de huidige pulsen rijden in de micro-elektrode biedt.
7. De micro-elektrode wordt voorzichtig geplaatst in het membraan van een neuron STG met behulp van een micro-elektrode manipulator (PatchStar, scientifica Ltd, Uckfield, Verenigd Koninkrijk). Sinds de werkafstand van het 10x objectief (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 mm, Olympus Corporation, Tokyo, Japan) van de imaging microscoop is erg klein, moet de micro-elektrode worden geplaatst in een schuine positie (rond de 30 °) en de beweging van de micro-elektrode in de juiste positie vereist een aantal stappen van de heroriëntatie van de microscoop doelstelling en het verplaatsen van de micro-elektrode. Om te beginnen de micro-elektrode wordt bewogen in een positie zodanig dat de tip is boven de STG. De microscoop doel is verlaagd totdat de elektrode punt scherp wordt weergegeven. Dan is het verder verlaagd, maar niet zo veel aan de micro-elektrode te raken. De micro-elektrode wordt verlaagd totdat het weer verschijnt in het brandpunt van de doelstelling. Deze stappen worden herhaald tot de neuronen duidelijk in de focus vlak van de doelstelling. Dan is de micro-elektrode wordt verlaagd tot het in aanraking komt en voorzichtig doorboort de membraan van de geselecteerde STG neuron. Dit wordt gecontroleerd met behulp van de oscilloscoop.
8. De intracellulaire elektrode wordt gebruikt om de activiteit van de geselecteerde STG neuron record in om het neuron gezien de activiteit van het profiel en de relatie tussen de activiteit en de STG activiteit opgenomen uit de extracellulaire elektrode ^2,3,7 te identificeren.
9. De intracellulaire versterker wordt ingeschakeld in de huidige injectie modus en wordt gebruikt voor 30 minuten tot 10 injecteren nA positieve stroom stappen in de micro-elektrode dat laatste voor 1 seconde en worden gescheiden door een seconde gaten terwijl er geen stroom geïnjecteerd in de micro-elektrode. De geïnjecteerde stroom drijft de positief geladen kleurstof moleculen in de opgenomen neuron. Als apparatuur is beschikbaar meerdere neuronen kunnen gelijktijdig worden geïnjecteerd.
10. Tien minuten in de injectie-periode en na het einde van de injectie de kleurstof verspreiding in het neuron is gecontroleerd. Om dit te doen gebruiken we de MiCAM02 imaging-systeem (SciMedia Ltd, Tokio, Japan) met het 10x objectief en verlichting door de ultra-lage rimpel halogeen lichtbron (HL-151; Moritex, Tokyo, Japan) door het filter kubus MSWG2 (met 480 tot 550 nm excitatie-filter, Olympus Corporation, Tokyo, Japan). De imaging systeem is ingesteld op de HR-camera met 192 x 128 pixels, 40 ms imaging tijd, de 'hbin' mode, en 10 frames per opnamesessie. Als de kleurstof vulling is succesvol de beeldvorming moeten tonen een geverfd patch in het neuron rond de locatie van de micro-elektrode, en dit geverfd patch moet groeien tussen de foto's genomen na 10 minuten en na 30 minuten. Als men de verspreiding van de kleurstof niet voldoende is na 30 min, is meer injectie tijd verleend. Als alternatief kan een nieuw kleurstof elektrode worden gebruikt.
11. De elektrode wordt getrokken uit de neuron en de neuron wordt overgelaten om te ontspannen voor ten minste 20-30 minuten. Binnen deze tijd kan de volgende neuron worden ingespoten met kleurstof.

4. Beeldvorming van Geverfd Neuronen

De activiteit van de afzonderlijke neuronen kunnen worden afgebeeld na de kleurstof vullen procedure. Als alternatief twee of meer neuronen kan worden gevuld tot het imago van de gelijktijdige activiteit van verschillende STG neuronen. In principe veel en mogelijk alle STG neuronen kan worden gevuld met kleurstof. De beeldvorming van de neuronen is gedaan met de Micam 02 imaging systeem met behulp van de HR-camera. De procedure van de beeldvorming is als volgt:

1. De microscoop doel is veranderd en een hoge lichttransmissie rendement 20x objectief (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD 2,0 mm, Olympus Corporation, Tokyo, Japan) wordt gebruikt voor de beeldvorming het verzamelen van gegevens. Deze doelstelling verzamelt veel meer licht dat het 10x objectief en ook hoger vergroting geeft meer gedetailleerde beeld van de neuronen. Bein g meer licht efficiënt middel dat kleine hoeveelheid kleurstof laden nu al zichtbaar is met dit doel en ook dat we kunnen lagere lichtintensiteit te gebruiken voor de beeldvorming waardoor het potentiële foto schade die mogelijk aan de neuronen worden veroorzaakt door de kleurstof.
2. De microscoop de operationele fase is geplaatst zodanig dat de neuronen die zijn bedoeld om te worden afgebeeld zijn op het gebied van licht van het doel en het doel is gericht op hen.
3. De extracellulaire gegevens worden ook ingevoerd in de Micam 02 imaging-systeem via de analoge ingang kanaal. Dit maakt het relatief eenvoudig over van optische signalen en de bijbehorende motorische patronen of extracellulair opgenomen pieken in de analyse fase.
4. Het Micam 02 systeem is ingesteld op 96 x 64 pixel resolutie te gebruiken met 2,2 ms imaging tijd of 48 x 32 pixel resolutie met 1,5 ms beeldvorming tijd. In beide gevallen is de 'hbin' instelling kan worden gebruikt als het verven van de neuronen is niet erg sterk.
5. Het licht wordt ingesteld zo laag mogelijk (dat wil zeggen de kleurstof in de neuronen moet nog steeds het genereren van voldoende fluorescentie voor de beeldvorming) om foto modulatie en foto beschadiging van de opgenomen neuronen te voorkomen.
6. De kamer verlichting en alle overige lichtbronnen zijn uitgeschakeld. Daarnaast kan een zwart gordijn worden gesloten rond de opname rig om blootstelling aan het licht van externe bronnen te voorkomen.
7. De beeldvorming sessies zijn ingesteld om te worden tussen de 4 - 16 seconden lang zijn.
8. De spontane activiteit van de geverfde neuronen wordt opgenomen over meerdere beeldvorming sessies.

5. Analyse van de Optical Imaging gegevens

Voor het analyseren van de beeldgegevens gebruikten we de BVAna software (versie 10.08, SciMedia Ltd, Tokio, Japan) in verband met de Micam 02 imaging systeem. De software ondersteunt de visualisatie van de beeldgegevens en biedt een scala aan analyse-instrumenten ook. De stappen van de data-analyse en interpretatie zijn als volgt:

1. Een geschikte cirkelvormig gebied van belang is geselecteerd op elke geregistreerde neuronen. Typisch gebruiken we 2 tot 3 pixels straal regio's van belang voor het onderzoek van neuronen in de 48 x 32 pixel resolutie, en 6 - 8 pixel radius regio's van belang voor het onderzoek van neuronen in 96 x 64 resolutie.
2. De temporele afvlakking van de gegevens die nodig kan zijn, vooral als de kleurstof relatief lage hoeveelheid fluorescentie (lage achtergrond waarde van de gegevens genereert, geeft aan dat dit, het kan te wijten zijn aan het lage lichtniveau dat wordt gebruikt of laag niveau kleurstof belasting, bijvoorbeeld in een neurieten van de opgenomen neuron). Meestal in zulke gevallen gebruiken we tijdelijk glad met 3 - 5 keer units.
3. In aanvulling op de optische opnames hebben we ook weer de extracellulaire door het selecteren van de analoge ingang van de imaging-systeem weer te geven.
4. De parameters voor de visualisatie van de optische gegevens en de analoge ingang moet correct zijn ingesteld om alle opnamen op de computer scherm te zien.
5. Gezien de optische opnames van de neuronen, de extracellulaire opname van de LVN, en de indeling van het neuron op basis van de eerdere intracellulaire opname, is het mogelijk om de identiteit van het neuron te bepalen en om haar activiteiten hebben betrekking op de neurale activiteiten opgenomen van de zenuw.
6. De verwachting is dat de optische opnamen laten duidelijk zien, en zonder de noodzaak van middeling over meerdere soortgelijke gebeurtenissen, de neurale activiteiten die overeenkomt met extracellulair opgenomen pieken en ook subthreshold evenementen zoals remmende postsynaptische potentialen veroorzaakt door de activiteit van andere neuronen.
7. De gegevens te exporteren functies van de BVAna software kan worden gebruikt om de optische opnames berekend voor de geselecteerde regio's van belang, maar ook de analoge input die de opname van de lvn bevat export. De geëxporteerde gegevens kunnen worden verwerkt en verder geanalyseerd met behulp van andere data-analyse software en (bijvoorbeeld in het eenvoudigste geval Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, Verenigde Staten) kan worden gebruikt voor extra visualisering en data-verwerking).

6. Representatieve resultaten

Figuur 2 toont de gelijktijdige opname van twee neuronen (LP, laterale pylorus neuron, PD, pylorus dilatator neuron) in de pyloris centrale patroon generator van een krab STG samen met de opname van de LVN. De optische opnamen van de LP en de PD neuronen geïdentificeerd op basis van hun intracellulaire opnames laten zien dat inderdaad deze passen goed bij de extracellulaire opnames die overeenkomen met LP en PD neuronen. Er is een consistent 12 ms vertraging tussen de optische en lvn opnamen van spike pieken (zie kader van figuur 2) als gevolg van de axonale transmissie vertraging tussen het ganglion en de extracellulaire site. De gepresenteerde gegevens blijkt ook dat de neurale activiteit in het soma die overeenkomt met pieken van de opgenomen neuronen duidelijk opspoorbaar is.

s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg "alt =" Afbeelding 1 "/>
Figuur 1. A) Schematische weergave van de stomatogastric zenuwstelsel (STNS). Cog, commissural ganglion, OG, slokdarm-ganglion, STG, stomatogastric ganglion, STN, stomatogastric zenuw, lvn, laterale ventrikel zenuw. B) De krab stomatogastric ganglion (STG) - de afbeelding ziet u de halfronde achterste plaatsing van STG neuronen.

Figuur 2. Gelijktijdige single-sweep opname van een PD-en een LP neuron, samen met de opname van de LVN. De gegevens blijkt dat dat de optische zenuw en de opnames passen heel goed en dat we kunnen identificeren van de neurale activiteiten die overeenkomt met spikes opgenomen vormen de zenuw. De inzet toont een overlay van verschillende sweeps van LP actiepotentialen - zowel optisch als elektrisch opgenomen - en hun gemiddelde aantonen van de match tussen optisch en elektrisch opgenomen activiteiten. Te wijten aan het feit dat onze optische recording methode niet filteren van de lage frequentie componenten van de gegevens die we ook in staat om langzaam membraanpotentiaal veranderingen die kenmerkend zijn voor PD en LP neuronen ¹⁴ op te nemen.

De spanning gevoelige kleurstof beeldvorming ^8,9 van de STG neuronen in combinatie met traditionele methodes elektrofysiologie (intra-en extracellulaire elektrode-opnames) kan een beter begrip van hoe dit kleine, bekende en nog steeds complexe neurale systeem werkt. De STG is een prototype van centrale patroon generator (CPG) neuronale netwerken (het omvat de pylorus en de maag molen ritme netwerken) ^{10,, 11,} dus een beter begrip van de opkomende functionele eigenschappen van de STG zal ook helpen om te begrijpen hoe in het algemeen CPG netwerken genereren hun netwerkniveau functionaliteit. CPG netwerken spelen een cruciale rol in de motorische controle ¹² en ook in de hogere cognitieve functies ^13, dus ook de beter begrip van hun emergente eigenschappen kunnen een grote impact hebben op veel gebieden van de neurowetenschappen.

Geen belangenconflicten verklaard.

Wij erkennen ondersteunen door de School voor Informatica en Faculteit der Natuurwetenschappen, Landbouw en Engineering van Newcastle University, de Universiteit van Ulm, en door de SciMedia Ltd (Tokyo, Japan).

1. Gutierrez, G.J., Grashow, R.G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. J Vis Exp, http://www.jove.com/index/details.stp?id=1207, doi: 10.3791/1207 (2009).
2. Bartos, M., Nusbaum, M.P. Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition. J. Neurosci, 17 : 2247-56 (1997).
3. Blitz, D.M., Nusbaum, M.P. Motor pattern selection via inhibition of parallel pathways. J Neurosci, 17 : 4965-75 (1997).
4. Stein, W., Smarandache, C.R., Nickmann, M., Hedrich, U.B. Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction. J Exp Biol, 209 : 1285-300 (2006).
5. Loew, L. Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes. Pure & Appl Chem, 68 : 1405-1409 (1996).
6. Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. J Neurosci Meth, 102 : 11-23 (2000).
7. Heinzel, H.G., Weimann, J.M., Marder, E. The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination. J Neurosci, 13 : 1793-803 (1993).
8. Zecevic, D., Wu, J-Y., Cohen, L.B., London, J.A., Höpp, H.P., Falk, C.X. Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex. J Neurosci, 9: 3681-3689 (1989).
9. Briggman, K.L., Kristan, W.B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. J Neurosci, 26 : 10925-10933 (2006).
10. Nusbaum, M.P., Beenhakker, M.P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature, 417 : 343-350 (2002).
11. Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Ann Rev Physiol, 69 : 291-316 (2007).
12. Grillner, S. Biological pattern generation: the cellular and computational logic of networks in motion. Neuron, 52 : 751-766 (2006).
13. Yuste, R., MacLean, J.N., Smith, J., Lansner, A. The cortex as a central pattern generator. Nat Rev Neurosci, 6 : 477-483 (2005).
14. Stein, W. Modulation of stomatogastric rhythms. J Comp Physiol A, 195 : 989-1009 (2009).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.