漂白后荧光标记蛋白的荧光恢复（FRAP）在培养海马神经元的树突棘

Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2568, doi:10.3791/2568 (2011).

FRAP已被用来量化GFP标记的蛋白质的流动性。使用一个强大的激励激光，一个GFP标记蛋白的荧光漂白，在感兴趣的区域。 GFP标记的来自该地区以外的的漂白蛋白扩散到感兴趣的区域时，该区域的荧光恢复。蛋白质的流动性进行了分析，通过测量荧光恢复率。这种技术可以用来描述蛋白质的流动性和周转率。

在这项研究中，我们对培养海马神经元（增强型绿色荧光蛋白）EGFP的载体。我们使用蔡司710共聚焦显微镜，光漂白的在一个单一的脊椎的绿色荧光蛋白的荧光信号，然后取时间的推移图像记录荧光漂白后恢复。最后，我们估计在刺的绿色荧光蛋白的移动和静止的分数的百分比，通过分析成像数据，使用ImageJ和Graphpad软件。

这FRAP协议显示了如何执行基本FRAP实验，以及如何对数据进行分析。

1。神经元转

1. 文化胚胎第18天（E18）大鼠海马神经元- D -聚赖氨酸包MatTek 35毫米的玻璃底^菜 1 。 （DIV），在16-18天的体外转染的神经元，使用Clontech公司CalPhos哺乳动物转染试剂盒。首先，用1.5毫升培养基代替贝科改良Eagle培养基 （DMEM），每35毫米盘0.5小时之前转。 （步骤1.6）使用，保存在一个无菌的15毫升管的原培养液。
2. 混合使用无菌H _{2 O（Clontech}公司）和12.4μL2米钙的解决方案（Clontech公司）的总体积100μL的10μg的pEGFP - N1质粒DNA。
3. 从步骤1.2）中添加的混合物100μL2 ×哈佛商学院滴加而涡旋2 ×哈佛商学院在中等速度。
4. 让坐在混合物在室温下放置20分钟，然后添加步骤1.3）DMEM培养液培养的神经元最终混合物。
5. 为1-1.5小时，放入37℃培养箱中培养的神经元。
6. 删除磷酸钙介质中，然后用DMEM三次洗细胞。在返回培养皿中的孵化器，交流与原培养液DMEM培养基。

2。在脊柱的FRAP实验

1. 用于转染后二至四天的FRAP实验的神经元。
2. 从35毫米的玻璃底菜更换培养液，立即加入预热Tyrode液，其中包含（毫米），HEPES 10 5 145氯化钠，氯化钾，葡萄糖10，甘氨酸_0.005，2.6氯化钙和氯化镁₂ 1.3（用NaOH调整pH至7.4）。
3. 蔡司LSM 710共聚焦显微镜是用于FRAP实验。蔡司TempModule系统是用来控制温度（37℃），湿度和工作系统的CO _{2（5％）。}确保连接和一瓶水，这是用来平衡湿度，是装满了水，CO ₂坦克。
4. 查找100 ×目标（αplan的复消色差透镜100 × / 1.46油）的转染成熟树突。如果在盘转染细胞稀疏，寻找所需的细胞与40 ×的目标（计划NEOFLUAR 40 × / 1.3油），然后切换到100 ×目标捕捉图像。
5. 使用5 ×光学变焦和256 × 256像素分辨率的图像一小段几个刺的枝蔓。要拍摄图像，使用额定转速（像素停留时间为3.15微秒）需要0.5秒完成扫描。针孔设置为2μm的获得较强的荧光。到图像时，尝试使用激光传输低，例如1-5％，以避免漂白的整个形象。
6. 选择感兴趣的脊椎。在我们的实验中，我们选择与他们的脊柱头部直径约1微米的蘑菇刺。
7. 为了做一个FRAP实验，漂白前5个控制影像，然后漂白脊柱利益标称100％激光传输的10倍[氩激光功率为30兆瓦，488激光线的50％（15毫瓦），和约3-4毫瓦，达到通过显微镜488激光线]，然后漂白后，立即捕捉了一系列的图像。在这个实验中，图像被捕获漂白后每15秒1秒。调整的时间间隔应根据不同的目标蛋白质和不同的实验设计（ 图1） 。
8. 保存图像。

3。数据分析

1. 与ImageJ软件中打开图像。
2. 对齐使用对齐工具图像的堆栈 - ImageJ（“插件”→“栈洗牌”→“对齐堆栈片”→“翻译”和/或“刚体”），使脊柱的利益不浮换句话说 - 它仍然在同一位置上的图像。
3. 测量相对利益_（F S）的脊椎，一个转，但漂白地区（对照组），在时间的推移图像和背景区域_（F B）的荧光强度，使用ImageJ工具“力度V时间显示器”（ “插件“→”栈 - 洗牌“→”强度V时间显示器“）。控制区域可以是一个倍受关注的远端树突的一块。背景区是一个非荧光的地区。
4. 计算前（F _C0）和_（F C）漂白后，通过比较控制区的荧光光漂白率（R ）。
   R = _F C / F _C0。
5. 目标脊柱的荧光强度（F）的规范如下：
   F _=（F S - _F B）/ R。
6. 曲线拟合Graphpad Prism软件一阶段的指数方程（ 图2）或官方所用的荧光强度的目标脊柱ř类似软件。
7. 计算移动的分数_（F M）和不动的一小部分_（一 ）由下列公式：
   _F M = _F∞/ F _0，
   其中_，F∞全面复苏后的荧光强度_，F 0是前漂白的荧光强度。
   _F的第I = 1 - F _米。

4。代表性的成果：

在这项研究中，我们执行一个成熟的海马神经元的FRAP实验。在18-22格，已形成了蘑菇刺。用我们的方法，在一个小区域的荧光强度的动态变化，如脊椎，可以被记录下来。

要分析的EGFP荧光恢复过程中，我们采取控制之前，漂白和5张1图像的每1在15秒漂白后立即第二。图像分辨率是足够的定量分析。标记的荧光蛋白的荧光恢复型材高度重复性。

我们还简要说明如何定义一个荧光蛋白的移动和静止的分数，使用ImageJ和Graphpad Prism软件。我们在这里展示的FRAP方法和分析，可以广泛应用于神经科学，细胞生物学等研究。

图1。FRAP EGFP荧光测量在脊柱从培养的海马神经元。红色箭头指示的漂白时间。照片代表前同一地区（预），0，1，5，10，15秒​​后漂白。字母S，C和B，分别标有脊柱，控制和背景区域。在实验过程中，神经元保持在37 ° C。比例尺，1微米。

图2。FRAP EGFP荧光曲线超过15秒的时间。绿线显示了原始的曲线;红线显示正常化的曲线。曲线上的点显示FRAP每隔1秒。一个阶段的指数方程拟合曲线。漂白前的平均荧光计为100％。在这个实验中，移动的比例（MF）是94％，在不动的分数（IF）为6％。

FRAP分析已被广泛使用在体内和体外^1-2研究。这种技术通常利用GFP 融合蛋白 ，虽然它也可以用红藻融合蛋白^3。这种分析是敏感的，可以用来描述GFP标记的蛋白质的流动性。

要产生有意义的FRAP分析，重要的是要避免不必要的漂白FRAP实验之前和期间。有两种方法来实现这一。首先，搜索和观察实验的神经元的过程要快。特别是，神经元与100X的目标很长一段时间的观察明显漂白的荧光。二，高的激光功率和频繁扫描，往往会增加漂白的可能性。因此，将需要计算在控制区域的漂白率，然后在实验地区的FRAP曲线正常化。正火的方法已被描述的协议（见步骤，细节为3.3-3.5）。

漂白步骤，也是确保获得良好FRAP结果的关键。在这个实验中，我们漂白利息的10倍，100％的激光传输的脊椎。这条件是足够的一个背景在一个固定的编制水平的脊柱荧光漂白的。因此，我们设置漂白后的荧光强度在0秒作为背景相同数量。根据在第一次扫描的速度，可能已经被检测到的荧光恢复大量感兴趣的蛋白质是流动性很强。

已经开发了许多荧光蛋白探针研究蛋白质动力学与FRAP。互补性办法，例如，使用photoactivatable GFP（PA - GFP的），或photoconvertible变种。连同FRAP还原技术，这些工具成为不可或缺的活细胞成像研究^4-6。

没有利益冲突的声明。

这项工作得到了国家耳聋与其他交流障碍研究所（NIDCD）校内计划。

1. Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B. & Wenthold, R. J. SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines. J Neurosci 30, 4757-4766, (2010).
2. Grati, M. et al. Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2. J Neurosci 26, 6386-6395, (2006).
3. Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., & Zhang, Y. Z. FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion. PLoS ONE 4, e5295, (2009).
4. Wiedenmann, J. & Nienhaus, G. U. Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family. Expert Rev Proteomics 3, 361-374, (2006).
5. Shaner, N. C., Patterson, G. H. & Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 120, 4247-4260, (2007).
6. Sprague, B. L. & McNally, J. G. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Trends Cell Biol 15, 84-91, (2005).

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