Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) флуоресценции меткой Белки в Дендритные Шипы культивированный нейронов гиппокампа

Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2568, doi:10.3791/2568 (2011).

FRAP была использована для количественной оценки подвижности GFP с метками белков. Использование сильного лазерного возбуждения флуоресценции GFP с метками белка отбеливается в области интереса. Флуоресценции области восстанавливается при небеленой GFP с метками белка из-за пределов региона диффундирует в область интересов. Подвижность белка затем анализируется путем измерения флуоресценции скорость восстановления. Этот метод может быть использован для характеристики подвижности белка и текучести кадров.

В этом исследовании, мы выражаем (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) EGFP вектор в культуре нейронов гиппокампа. Использование Zeiss 710 конфокальной микроскопии, мы photobleach флуоресценции сигнал GFP белка в одном позвоночника, а затем получать изображения промежуток времени для записи флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания. Оценим, наконец, процент подвижных и неподвижных доли GFP в шипы, на основе анализа данных с использованием изображений ImageJ и GraphPad программного обеспечения.

Этот протокол FRAP показано, как выполнять основные эксперимент FRAP, а также, как анализировать данные.

1. Нейрон трансфекции

1. Культуры эмбриональных крыс день 18 (E18) нейронов гиппокампа на поли-D-лизин покрытием Маттек 35-мм со стеклянным дном блюда ^1. На 16-18 дней в пробирке (DIV), трансфекции нейронов использованием Clontech CalPhos млекопитающих Kit трансфекции. Во-первых, заменить культуральной среде с 1,5 мл изменения Eagle Дульбеко среднего (DMEM) в 35-мм блюдо 0,5 часа до трансфекции. Сохраните оригинальную питательную среду в стерильные 15 мл трубку для последующего использования (шаг 1,6) использования.
2. Смешайте 10 мкг pEGFP-N1 ДНК плазмиды стерильной H ₂ O (Clontech) и 12,4 мкл 2 М раствор кальция (Clontech) до общего объема 100 мкл.
3. Добавить смесь из шага 1.2) до 100 мкл 2 × HBS по каплям при вортексе 2 × HBS на средней скорости.
4. Пусть смесь сидеть при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем добавить конечной смеси с шага 1.3) в DMEM-инкубировали нейронов.
5. Положите нейронов обратно в 37 ° C инкубатора в течение 1-1,5 часов.
6. Удалить из фосфата кальция среде, содержащей, затем промыть клетки с DMEM три раза. Перед возвращением культуры блюдо инкубатор, обмен среде DMEM с оригинальным питательной среды.

2. FRAP эксперимент по позвоночнику

1. Нейроны используются для FRAP эксперимент двух до четырех дней после трансфекции.
2. Замените культуральной среде с 35-мм со стеклянным дном тарелку, добавив, немедленно подогретого Tyrode Решение, которое содержит (в мМ) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, Глюкоза 10, Глицин 0,005, CaCl ₂ 2.6 и MgCl ₂ 1.3 (рН до 7,4 с NaOH).
3. Zeiss LSM 710 конфокальной микроскопии используется для FRAP эксперимента. Система Zeiss TempModule используется для контроля температуры (37 ° С), влажности и CO ₂ (5%) из работающей системы. Убедитесь, что CO _2, танк подключен и бутылку воды, которая используется для балансировки влажности, заполнен водой.
4. Найти трансфицированных зрелых дендритных с 100 × цели (αplan-Apochromat 100 × / 1,46 масла). Если трансфекции клеток в блюдо редкие, поиск нужную ячейку с 40 × цель (план-NEOFLUAR 40 × / 1,3 масла), а затем переключиться на 100 × цель для захвата изображений.
5. Используйте 5 × оптический зум и 256 × 256 пикселей на изображение небольшой фрагмент дендрита с несколькими шипами. Для захвата изображения, использовать номинальной скорости 9 (пиксель время задержки 3,15 мкс), который занимает 0,5 секунды, чтобы закончить проверку. Обскуры установлен в 2 мкм, чтобы получить сильную флуоресценцию. При съемке изображений, попробуйте использовать низкие передачи лазера, например, 1-5%, чтобы избежать фотообесцвечивания всего изображения.
6. Выберите позвоночника интересов. В нашем эксперименте мы выбираем гриб шипами с позвоночником головы диаметром ~ 1 мкм.
7. Для этого FRAP эксперимент, возьмите 5 изображений контроль до отбеливания, то отбеливатель позвоночника интерес в 10 раз при номинальной 100% лазерной передачи [власти аргонового лазера составляет 30 мВт, при этом 50% (15 мВт) в 488 лазерных линий, а примерно 3-4 мВт достигает микроскопом через 488 лазерных линий], а затем захват серии изображений сразу после отбеливания. Для этого эксперимента, что изображения будут захвачены каждую 1 секунду в течение 15 секунд после отбеливания. Промежуток времени должен быть скорректирован в зависимости от различных ориентации белков и различных экспериментальных конструкций (рис. 1).
8. Сохранение изображений.

3. Анализ данных

1. Открытие изображений с ImageJ программного обеспечения.
2. Выровняйте стопку фотографий с помощью инструмента выравнивания ('стеки - перетасовка "," плагины "→ →" выровнять ломтики в стеке' → «перевод» и / или «твердого тела») в ImageJ, так, чтобы позвоночник интерес не плавает , другими словами - он остается в том же положении на изображении.
3. Мера относительной интенсивности флуоресценции позвоночника интереса (F _ы), трансфицированных но небеленой регионе (контроль), и фона области (F _б) в образах промежуток времени, используя инструмент "Интенсивность V Time Monitor 'из ImageJ (" плагинов '→' стеки - перетасовка '→' Интенсивность V Time Monitor "). Контроль региона может быть частью целенаправленной дистальных дендрита. Фон регионе не является люминесцентная регионе.
4. Рассчитать фотообесцвечивания ставка (г), сравнивая флуоресценции контрольного региона до (F _c0) и после (F _в) фотообесцвечивания.
   г = F _C / F _с0.
5. Нормализация интенсивности флуоресценции целевой позвоночника (F) следующим образом:
   F = (F _ы - F _б) / r.
6. Кривая соответствует интенсивности флуоресценции целевой позвоночника с однофазной экспоненциальным уравнением программного обеспечения Призма GraphPad (рис. 2) или КетеГ подобного программного обеспечения.
7. Рассчитать мобильных фракции (е _м) и неподвижные фракции (е _я) следующими уравнениями:
   _F M = F _∞ / F _0,
   где F _∞ является интенсивность флуоресценции после полного восстановления, а F ₀ является интенсивность флуоресценции до фотообесцвечивания.
   F ₌ 1 - е _м.

4. Представитель Результаты:

В этом исследовании мы проводим эксперимент по FRAP зрелых нейронов гиппокампа. На 18-22 DIV, грибы шипы уже сформировались. Используя наш метод, динамические изменения интенсивности флуоресценции в небольшой области, например, позвоночника, могут быть записаны.

Для анализа флуоресценции процесс восстановления EGFP, мы берем 5 изображений в качестве контроля перед отбеливанием, а затем 1 изображение каждые 1 секунды сразу после отбеливания в течение 15 секунд. Разрешение изображения достаточно для количественного анализа. Флуоресценции профилей восстановления меченых флуоресценции белков высокой воспроизводимостью.

Мы также кратко показать, как определить подвижные и неподвижные доли флуоресценции белка, используя ImageJ и GraphPad Призма программного обеспечения. Метод FRAP и анализа мы показываем здесь, могут быть широко использованы в неврологии, клеточной биологии и других исследований.

Рисунок 1. FRAP измерения флуоресценции EGFP в позвоночнике от культурных гиппокампа нейрона. Красные стрелки указывают время фотообесцвечивания. Фотографии представляют той же области до (Pre) и 0, 1, 5, 10, 15 секунд после фотообесцвечивания. Отделе позвоночника, контроль и фона, помечены буквами S, C и B, соответственно. Нейроны были сохранены при 37 ° С в течение эксперимента. Шкала бар, 1 мкм.

Рисунок 2. FRAP кривых флуоресценции EGFP в течение 15-секундного периода. Зеленая линия показывает оригинальной кривой, красная линия показывает нормированный кривой. Точками на кривых показывают FRAP каждую 1 секунду. Кривые были установлены на одну фазу показательные уравнения. Средний флуоресценции до фотообесцвечивания считался 100%. В этом эксперименте мобильных фракции (MF) составляет 94%, а неподвижные фракции (ИФ) составляет 6%.

FRAP анализ был широко используются в естественных условиях и в пробирке ^1-2 исследований. Эта техника широко использует GFP слитых белков , хотя она может также использовать красные водоросли белков слияния ^3. Этот анализ чувствительны и могут быть использованы для характеристики мобильности GFP с метками белков.

Для получения полноценного анализа FRAP, важно, чтобы избежать ненужных фотообесцвечивания до и во время FRAP эксперимента. Есть два пути для достижения этого. Во-первых, процесс поиска и наблюдения экспериментальных нейрон должен быть быстрым. В частности, наблюдения нейронов с 100X цель в течение длительного времени значительно отбеливает флуоресценции. Во-вторых, высокая мощность лазерного сканирования и частые часто увеличивают возможность фотообесцвечивания. Таким образом, необходимо будет рассчитать фотообесцвечивания ставка в контрольной области, а затем нормализовать FRAP кривой в экспериментальной области. Нормализации метод был описан в протоколе (см. шаг 3.3-3.5 право).

Фотообесцвечивания шаг также решающее значение для обеспечения хороших результатов FRAP. В этом эксперименте мы отбеливателя позвоночника интерес в 10 раз при 100 передачи лазерного%. Это условие является достаточным, чтобы отбелить флуоресценции позвоночника к фоновому уровню в фиксированном подготовки. Таким образом, мы устанавливаем интенсивности флуоресценции на тот же номер в качестве фона на 0 секунд после фотообесцвечивания. В зависимости от скорости первого сканирования, значительное количество флуоресценции восстановления, возможно, уже обнаружена, когда белок является очень мобильны.

Многие флуоресцентных зондов белка были разработаны для изучения динамики белков с FRAP. Дополнительный подход является, например, использовать фотоактивируемых GFP (PA-GFP), или photoconvertible вариантов. Вместе с FRAP техники, эти инструменты становятся необходимыми для живой клетки диагностическая визуализация ^4-6.

Нет конфликта интересов объявлены.

Работа выполнена при поддержке Национального института глухоты и других расстройств связи (NIDCD) Внутренние программы.

1. Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B. & Wenthold, R. J. SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines. J Neurosci 30, 4757-4766, (2010).
2. Grati, M. et al. Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2. J Neurosci 26, 6386-6395, (2006).
3. Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., & Zhang, Y. Z. FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion. PLoS ONE 4, e5295, (2009).
4. Wiedenmann, J. & Nienhaus, G. U. Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family. Expert Rev Proteomics 3, 361-374, (2006).
5. Shaner, N. C., Patterson, G. H. & Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 120, 4247-4260, (2007).
6. Sprague, B. L. & McNally, J. G. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Trends Cell Biol 15, 84-91, (2005).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.