שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2568, doi:10.3791/2568 (2011).

FRAP נעשה שימוש כדי לכמת את הניידות של ה-GFP-tagged חלבונים. באמצעות לייזר עירור חזק, הקרינה של חלבון ה-GFP-תייג הוא מחומצן באזור של עניין. הקרינה של האזור מתאושש כאשר חלבון מולבן GFP-tagged מבחוץ האזור מתמוסס לתוך האזור של עניין. ניידות של החלבון הוא ניתח אז על ידי מדידת קצב התאוששות פלואורסצנטי. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לאפיין ניידות חלבון התחלופה.

במחקר זה, אנו מביעים את וקטור (משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק) EGFP של נוירונים בהיפוקמפוס תרבותי. באמצעות מיקרוסקופ Zeiss 710 confocal, אנו photobleach את האות פלואורסצנציה של חלבון ה-GFP בעמוד השדרה אחת, ולאחר מכן לקחת זמן לשגות תמונות כדי להקליט את ההתאוששות לאחר photobleaching פלואורסצנטי. לבסוף, אנו מעריכים את אחוז שברים ניידים תנועה של ה-GFP של עמוד השדרה, על ידי ניתוח נתוני הדמיה באמצעות ImageJ ותוכנות Graphpad.

זה פרוטוקול FRAP מראה כיצד לבצע ניסוי FRAP בסיסי וכן כיצד לנתח את הנתונים.

1. Neuron transfection

1. תרבות יום עובריים 18 (E18) נוירונים בהיפוקמפוס חולדה על poly-d-ליזין מצופה MatTek 35 מ"מ זכוכית התחתונה מנות ^1. ב 16-18 ימים במבחנה (DIV), נוירונים transfect באמצעות ערכת CalPhos Clontech transfection יונקים. ראשית, להחליף את התרבות בינוני עם 1.5 מ"ל השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) לכל 35 מ"מ לשעה צלחת 0.5 לפני transfection. שמור את המדיום התרבות המקורית בתוך שפופרת 15 מ"ל סטרילי לשימוש (שלב 1.6) מאוחר יותר.
2. מערבבים 10 pEGFP-N1 מיקרוגרם DNA פלסמיד עם סטרילי H ₂ O (Clontech) ו 12.4 פתרון μl 2 M סידן (Clontech) עד נפח כולל של μl 100.
3. מוסיפים את תערובת משלב 1.2) עד 100 μl 2 × בהרוורד dropwise בעוד vortexing 2 × בהרוורד במהירות בינונית.
4. בואו התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ולאחר מכן להוסיף את תערובת הסופי משלב 1.3) לתוך DMEM-מודגרות נוירונים.
5. שים את הנוירונים בחזרה 37 ° C חממה 1-1.5 שעות.
6. הסר את פוספט המכילים סידן בינוני, ולאחר מכן לשטוף עם תאים DMEM שלוש פעמים. לפני החזרת צלחת תרבות, חממה חילופי בינוני DMEM עם המדיום התרבות המקורית.

2. FRAP הניסוי על עמוד השדרה

1. הנוירונים משמשים לצורך הניסוי FRAP 2-4 ימים לאחר transfection.
2. החלף את המדיום תרבות מצלחת הזכוכית התחתונה בגודל 35 מ"מ, על ידי הוספת מיד טרום התחמם הפתרון Tyrode, אשר מכיל (מ"מ) 145 NaCl, KCl 5, HEPES 10, 10 גלוקוז, גליצין 0.005, CaCl ₂ 2.6, ו - MgCl ₂ 1.3 (pH 7.4 המותאמת עם NaOH).
3. LSM Zeiss 710 מיקרוסקופ confocal משמש הניסוי FRAP. המערכת TempModule Zeiss משמש לשליטה בטמפרטורה (37 ° C), הלחות ואת ה-CO ₂ (5%) של המערכת עובדת. ודא כי המיכל ₂ CO מחובר את בקבוק המים, אשר משמש לצורך איזון הלחות, מתמלא מים.
4. מצא דנדריט בוגרת transfected במטרה × 100 (αplan-APOCHROMAT 100 × / 1.46 שמן). אם התאים transfected בצלחת הם החיפוש דלילה, לתא הרצוי עם 40 × אובייקטיבי (תוכנית NEOFLUAR-40 × / 1.3 שמן), ולאחר מכן לעבור את 100 × המטרה ללכוד תמונות.
5. השתמש 5 × זום אופטי ו 256 × 256 פיקסלים ברזולוציה לתמונה קטע קצר של דנדריט עם שדרות מספר. כדי ללכוד תמונות, שימוש מהירות נומינלית 9 (3.15 פיקסל להתעכב זמן μsec) אשר לוקח 0.5 שנייה לסיום הסריקה. חריר מוגדר 2μm להשיג הקרינה חזקה. כאשר לוקחים תמונות, נסה להשתמש שידור לייזר נמוך, למשל 1-5%, כדי למנוע photobleaching את התמונה כולה.
6. בחר את עמוד השדרה של עניין. בניסוי שלנו, אנו בוחרים פטריות עם קוצים בראש עמוד השדרה שלהם בקטרים ​​של ~ 1 מיקרומטר.
7. כדי לעשות ניסוי FRAP, לקחת 5 תמונות לשלוט לפני הלבנה, אז להלבין את עמוד השדרה של הריבית 10 פעמים ב שידור הנומינלי לייזר 100% [כוח לייזר ארגון היא 30 mW, עם 50% (15 mW) בקו 488 הלייזר mW 3-4 בערך מגיע מיקרוסקופ באמצעות קו 488 הלייזר], ולאחר מכן ללכוד סדרה של תמונות מיד לאחר הלבנה. לצורך ניסוי זה, תמונות נלכדים כל שנייה 1 למשך 15 שניות אחרי הלבנה. מרווח הזמן צריך להיות מותאם על פי מיקוד חלבונים שונים, עיצובים ניסיוניים שונים (איור 1).
8. שמור תמונות.

3. ניתוח נתונים

1. פתיחת תמונות עם תוכנה ImageJ.
2. יישר את ערימת התמונות באמצעות הכלי ליישר ("ערימות - דשדוש 'תוספים' → →" ליישר הפרוסות בערימה 'גוף נוקשה "→" תרגום "ו / או) ב ImageJ, כך עמוד השדרה של עניין לא לצוף במילים אחרות - הוא נשאר באותה תנוחה על התמונה.
3. מדידת עוצמת הקרינה היחסית של עמוד השדרה של עניין (F _ים), אזור transfected אבל מולבן (שליטה), ואזור רקע (F _ב) תמונות זמן לשגות, באמצעות הכלי "עוצמת v זמן מסך 'של ImageJ (" plugins "→" ערימות - מדשדש "→" אינטנסיביות זמן v Monitor "). אזור השליטה יכולה להיות חתיכת דנדריט היטב ממוקד דיסטלי. האזור הרקע הוא אזור לא פלורסנט.
4. לחשב את שיעור photobleaching (r) על ידי השוואת הקרינה באזור השליטה לפני (F _c0) ואחרי (F _ג) photobleaching.
   r = F _ג / F _c0.
5. נרמל את עוצמת הקרינה של עמוד השדרה היעד (F) כדלקמן:
   F = (F _ר - נ _ב) / r.
6. Curve להתאים את עוצמת הקרינה של עמוד השדרה היעד עם משוואה אחת בשלב מעריכי של תוכנת Prism Graphpad (איור 2) או other תוכנה דומה.
7. חישוב חלק ניידים (ו _{מ ')} שבר נייח (ו _ט) על ידי המשוואות הבאות:
   f _מ = _∞ F / F _0,
   היכן F _∞ היא עוצמת הקרינה לאחר החלמה מלאה, ו-F ₀ הוא את עוצמת הקרינה לפני photobleaching.
   f _i = 1 - ו _{מ '}

4. נציג תוצאות:

במחקר זה, אנו מבצעים ניסוי FRAP על נוירונים בהיפוקמפוס מבוגר. בשלב DIV 18-22, קוצים פטריות נוצרות כבר. בשיטה שלנו, שינויים הדינמי של עוצמת הקרינה באזור קטן, כגון עמוד שדרה, ניתן להקליט.

כדי לנתח את תהליך ההתאוששות של הקרינה EGFP, אנחנו לוקחים 5 תמונות כפקדי לפני הלבנה ואז תמונה 1 כל 1 שנייה מיד לאחר הלבנת למשך 15 שניות. הרזולוציה של התמונה מספיק עבור ניתוח כמותי. פרופילים התאוששות הקרינה של חלבונים פלואורסצנטי מתויג ולייצר מאוד.

אנחנו גם בקצרה להראות איך להגדיר את השברים נייד נייח של חלבון פלואורסצנטי, באמצעות ImageJ ותוכנה Graphpad פריזמה. השיטה FRAP וניתוח אנו מציגים כאן ניתן להשתמש בהרחבה במדעי המוח, ביולוגיה של התא ומחקרים אחרים.

באיור 1. FRAP מדידות של הקרינה EGFP בעמוד השדרה מן הנוירון בהיפוקמפוס תרבותי. ראשי חץ אדום עולה הזמן של photobleaching. תמונות מייצגות את אותו אזור לפני (קדם) ו ב 0, 1, 5, 10, 15 שניות אחרי photobleaching. האזור של שליטה על עמוד השדרה, ועל רקע מסומנים באותיות S, C ו-B, בהתאמה. נוירונים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס במהלך הניסוי. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר.

איור 2. עקומות FRAP של EGFP הקרינה במשך 15 שניות. הקו הירוק מראה את העיקול המקורי; הקו האדום מראה את עקומת מנורמל. נקודות על עקומות המופע FRAP כל שנייה 1. עקומות הותאמו על ידי אחד בשלב משוואות מעריכי. הקרינה הממוצעת לפני photobleaching היה נחשב 100%. בניסוי זה, את החלק היחסי ניידים (MF) הוא 94% ועל חלק נייח (IF) הוא 6%.

ניתוח FRAP נעשה שימוש רחב in vivo ו in vitro ^1-2 ללימודים. טכניקה זו בדרך כלל מנצל GFP חלבונים היתוך , למרות שזה יכול גם להשתמש באדום חלבונים אצה היתוך ^3. ניתוח זה הוא רגיש והוא יכול לשמש כדי לאפיין את הניידות של ה-GFP-tagged חלבונים.

כדי לייצר ניתוח FRAP משמעותי, חשוב להימנע photobleaching מיותר לפני ובמהלך הניסוי FRAP. ישנן שתי דרכים להשיג זאת. ראשית, תהליך לחפש ולבחון את נוירון ניסיוני צריכה להיות מהירה. במיוחד, תצפית של נוירונים עם מטרה 100x במשך תקופה ארוכה באופן משמעותי את הקרינה הלבנה. הכוח השני, לייזר גבוהה סריקה תכופות לעתים קרובות להגדיל את האפשרות של photobleaching. לפיכך, יהיה צורך לחשב את שיעור photobleaching באזור שליטה ואז לנרמל את עקומת FRAP באזור הניסוי. שיטת נרמול תוארה בפרוטוקול (ראה שלב 3.3-3.5 לפרטים נוספים).

הצעד photobleaching גם קריטי להבטחת תוצאות FRAP טוב. בניסוי זה, אנו להלבין את עמוד השדרה של הריבית 10 פעמים ב שידור לייזר 100%. מצב זה מספיק כדי להלבין את הקרינה של עמוד השדרה לרמה רקע כהכנה קבוע. לפיכך, אנו קובעים את עוצמת הקרינה למספר זהה רקע על 0 שניות לאחר photobleaching. תלוי במהירות הסריקה הראשונה, כמות משמעותית של התאוששות הקרינה עלולה להתגלות כבר כאשר החלבון של הריבית ניידים מאוד.

רבים בדיקות חלבון פלואורסצנטי פותחו ללמוד הדינמיקה חלבון עם FRAP. גישה משלימה היא, למשל, להשתמש photoactivatable GFP (PA-GFP), או גרסאות photoconvertible. יחד עם טכניקה FRAP, כלים אלה הופכים הכרחי לחיות הדמיה מחקרים תא ^4-6.

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (NIDCD) תוכנית עירונית.

1. Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B. & Wenthold, R. J. SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines. J Neurosci 30, 4757-4766, (2010).
2. Grati, M. et al. Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2. J Neurosci 26, 6386-6395, (2006).
3. Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., & Zhang, Y. Z. FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion. PLoS ONE 4, e5295, (2009).
4. Wiedenmann, J. & Nienhaus, G. U. Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family. Expert Rev Proteomics 3, 361-374, (2006).
5. Shaner, N. C., Patterson, G. H. & Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 120, 4247-4260, (2007).
6. Sprague, B. L. & McNally, J. G. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Trends Cell Biol 15, 84-91, (2005).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.