培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2568, doi:10.3791/2568 (2011).

FRAPは、GFPタグ融合タンパク質の流動性を定量化するために使用されています。強力な励起レーザーを用いて、GFP -タグ付きタンパク質の蛍光は、関心領域で漂白されている。地域の外から無漂白のGFP -タグタンパク質は、関心領域に拡散する際の領域の蛍光が回復します。タンパク質の移動度は、その後、蛍光回収率を測定することによって分析されます。この手法は、タンパク質の移動度と回転率を特徴付けるために使用することができる。

本研究では、我々は培養海馬ニューロンの（強化された緑色蛍光タンパク質）EGFPのベクトルを表現する。ツァイス710共焦点顕微鏡を用いて、我々は、単一スパインのGFPタンパク質の蛍光信号を光退色し、光退色後蛍光回復を記録するタイムラプス画像を撮影する。最後に、我々はImageJとグラフパッドソフトを使用して画像データを解析することにより、棘におけるGFPの携帯電話と不動画分の割合を推定する。

このFRAPプロトコルは、基本FRAP実験を実施するだけでなく、データを分析する方法を方法を示しています。

1。ニューロンのトランスフェクション

1. ポリ- D -リジンコートマテックで文化胎生18日（E18）ラット海馬ニューロンは、35 mmのガラスボトムディッシュ^1。 in vitroでの上で16〜18日（DIV）、クロンテックCalPhos哺乳類のトランスフェクションキットを用いてトランスフェニューロン。最初に、1.5 mlの培養液を交換してダルベッコ改変イーグル培地トランスフェクション前に35 - mmディッシュ0.5時間ごとに（DMEM）。後で（ステップ1.6）を使用するための滅菌15 mlのチューブに元の培養培地を保存します。
2. 滅菌H ₂ O（Clontech）および100μlの総体積は12.4μlの2 Mのカルシウム溶液（Clontech社）と10μgのpEGFPを- N1プラスミドDNAを混ぜる。
3. ステップ1.2）から100μlの2 ×ボルテックス2時間HBS滴下× HBS中程度の速度で混合物を追加。
4. 混合物を室温で20分間座って、次にDMEMインキュベートしたニューロンにステップ1.3）から、最終的な混合物を追加してみましょう。
5. 1〜1.5時間37℃のインキュベーターに戻しニューロンを置く。
6. リン酸カルシウムを含有する培地を除去し、DMEMで3回細胞を洗浄。オリジナルの培地と交換、インキュベーターにDMEM培地を培養皿を返す前に。

2。脊椎に関するFRAP実験

1. ニューロンは、2〜4日トランスフェクション後FRAP実験に使用されます。
2. すぐに（mMで）塩化ナトリウム145、KClの5、HEPES 10、グルコース10、グリシン0.005、CaCl _2の 2.6、およびMgClを含む予め温めておいたタイロード溶液を、追加することで、35mmのガラスボトムディッシュから培養液を交換してください₂ 1.3（NaOHで7.4に調整pHを）。
3. ツァイスLSM 710共焦点顕微鏡は、FRAP実験に使用されます。ツァイスのTempModuleシステムは、温度（37℃）、湿度及び作業システムのCO _2（5％）を制御するために使用されます。 CO ₂タンクが接続されていると湿度のバランスをとるために使用される水のボトルは、水で満たされていることを確認してください。
4. 100 ×目標（αplan-アポクロマート100 × / 1.46オイル）でトランスフェクトされた成熟した樹状突起を見つける。の場合皿のトランスフェクションされた細胞は、その後、40 ×対物レンズ（プラン- NEOFLUAR 40 × / 1.3オイル）、および100に切り替え×画像をキャプチャする目的で、目的のセルを検索してスパースです。
5. 5 ×画像へ光学ズームと256 × 256ピクセルの解像度のいくつかの棘によるデンドライトの短い断片を使用してください。画像をキャプチャするには、0.5秒のスキャンを終了するまでの公称速度9（ピクセルは、時間3.15マイクロ秒の滞留）を使用します。ピンホールは、強い蛍光を取得するために2μmのために設定されています。画像を撮影するとき、画像全体を光退色を避けるために、例1-5％を、低レーザ伝送を使用するようにしてください。
6. 興味の背骨を選択します。私たちの実験では、我々は〜1μmの彼らの背骨の頭の直径とキノコ棘を選択してください。
7. FRAP実験を行うには、公称100％のレーザー伝送に関心の漂白剤脊椎その後、漂白前に10回を5コントロールの画像を取る[アルゴンレーザーのパワーは488レーザーラインの50％（15 MW）で、30mWです、と約3-4 mWのは488レーザーライン]を介して顕微鏡に達し、その後すぐに、漂白後の一連の画像をキャプチャ。この実験では、画像を漂白した後、15秒間1秒ごとにキャプチャされます。時間の間隔は、異なる標的タンパク質と異なる実験デザイン（ 図1）にしたがって調整する必要があります。
8. 画像を保存します。

3。データの分析

1. ImageJのソフトウェアで画像を開きます。
2. 興味の背骨がフロートしないようにImageJの中の - （→→"翻訳"および/または"剛体""スタック内のスライスを整列'プラグイン"→"シャッフルスタック'）は、位置合わせツールを使って画像のスタックの位置を合わせます、他の言葉で - それは、画像上の同じ位置に留まります。
3. ImageJの"強度Vタイムモニター"ツール（"プラグインを使用して、関心の背骨（F _S）、トランスフェクトが無漂白地域（対照）、および時間経過の画像における背景領域（F _B）の相対的蛍光強度を測定"→"スタック - シャッフリング"→"輝度Vタイムモニター"）。制御領域は十分に焦点を当てた遠位樹状突起の一部である可能性があります。背景領域は、非蛍光の領域です。
4. 前（F _C0）と（F _C）光退色後の制御領域の蛍光を比較することにより、退色率（r）を計算する。
   R = F _C / F _c0を 。
5. 次のようにターゲットの背骨の蛍光強度（F）を正規化：
   F =（F _S - F _B）/ R.
6. 曲線は、一相指数関数グラフパッドプリズムソフトウェアの式（ 図2）またはパーソナルプラグインを使用してターゲット背骨の蛍光強度に適合R同様のソフトウェア。
7. 次の式でモバイル割合（F _M）と不動の割合を（F _i）を計算してください。
   F _M = _F∞/ F _0、
   ここで_、F∞完全復旧後の蛍光強度であり、F _0は、退色前の蛍光強度である。
   _は f i = 1 - fを_mと

4。代表的な結果：

本研究では、我々は成熟した海馬神経細胞でFRAP実験を行う。 18から22 DIVで、キノコの棘が既に形成されています。私たちの方法を使用して、このような背骨のような小さな領域での蛍光強度の動的な変更は、記録することができます。

EGFPの蛍光回復のプロセスを分析するために、我々は、漂白してから、すぐに15秒のために漂白後の1秒ごとに1つのイメージの前のコントロールなどの5枚を取る。画像の解像度は、定量分析のために十分です。タグ付き蛍光タンパク質の蛍光回復のプロファイルは、再現性の高いです。

我々はまた、簡単にImageJとグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して、蛍光タンパク質の携帯電話と不動の分数を定義する方法を示しています。我々がここに表示FRAP法及び解析は、大きく分けて神経科学、細胞生物学と他の研究で使用することができます。

図1培養海馬ニューロンから脊椎におけるEGFP蛍光のFRAP測定。赤い矢印は退色の時間を示している。写真は光退色後の前（プレ）と0（ゼロ）の同じ面積、1、5、10、15秒を表します。脊椎の領域、制御および背景はそれぞれ、文字S、CとBとマークされます。ニューロンは、実験中に37℃に維持した。スケールバーは1μm。

図2 15秒の期間にわたってEGFP蛍光のFRAP曲線。緑の線は元の曲線を示し、赤い線は、正規化曲線を示しています。曲線上の点は、FRAPごとに1秒を示しています。曲線は、一相指数関数式でフィッティングした。退色前の平均蛍光を100％としてカウントした。この実験では、モバイル割合（MF）は94％と不動の割合は、（IF）6％です。

FRAP分析は広くin vivoおよび in vitro ^1月2日の研究で使用されています。この手法は、一般的にGFPを利用して融合タンパク質を 、それはまた紅藻の融合タンパク質^3を使用^することもできますが、。この分析では、小文字を区別し、GFPタグ融合タンパク質の流動性を特徴付けるために使用することができます。

意味のあるFRAP解析を生成するには、それは前とFRAP実験時の不要な光退色を避けることが重要です。これを達成するために二つの方法があります。最初に、検索と実験的なニューロンを観察するプロセスは、高速でなければなりません。特に、長い時間の100倍の目標を持つ神経細胞の観察が著しく蛍光を漂白剤。第二に、高レーザパワーと頻繁にスキャンが頻繁に光退色の可能性を高める。従って、それは制御領域の光退色率を計算し、実験地域のFRAP曲線を正規化するために必要となります。正規化の方法は、（詳細については、ステップ3.3から3.5を参照）のプロトコルに記載されている。

退色のステップはまた、良好なFRAPの結果を保証するために重要です。この実験では、我々は、漂白剤100％のレーザー伝送における利益の10倍の背骨を。この条件では、漂白剤の固定の準備のバックグラウンドレベルまで背骨の蛍光に十分です。従って、我々は、光退色後0秒で背景と同じ数に蛍光強度を設定します。最初のスキャンの速度に応じて、蛍光回復のかなりの量は、すでに目的のタンパク質は、モバイル性の高いときに検出されることがあります。

多くの蛍光タンパク質プローブは、FRAPと蛋白質のダイナミクスを研究するために開発されている。補完的なアプローチは、光活性化GFP（PA - GFP）、またはphotoconvertibleバリアントを使用するために、例えば、です。一緒にFRAP技術と、これらのツールは、ライブセルイメージング研究^4-6不可欠になりつつあります。

利害の衝突は宣言されません。

この作品は、難聴やその他のコミュニケーション障害に関する国立研究所（NIDCD）学内プログラムによってサポートされていました。

1. Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B. & Wenthold, R. J. SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines. J Neurosci 30, 4757-4766, (2010).
2. Grati, M. et al. Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2. J Neurosci 26, 6386-6395, (2006).
3. Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., & Zhang, Y. Z. FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion. PLoS ONE 4, e5295, (2009).
4. Wiedenmann, J. & Nienhaus, G. U. Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family. Expert Rev Proteomics 3, 361-374, (2006).
5. Shaner, N. C., Patterson, G. H. & Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 120, 4247-4260, (2007).
6. Sprague, B. L. & McNally, J. G. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Trends Cell Biol 15, 84-91, (2005).

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