使用一种基因编码的钙传感器来监测细胞凋亡过程中线粒体钙水平的动态变化

Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor. J. Vis. Exp. (50), e2579, doi:10.3791/2579 (2011).

在各种刺激的反应的细胞内钙离子浓度的动态变化调节许多细胞过程，如增殖^，分化和凋亡1。在促进细胞凋亡，线粒体中钙积累从线粒体释放促凋亡因素， ^进入细胞质2。因此，利益直接测量原位活细胞线粒体钙在细胞凋亡过程中。高分辨率荧光成像与双激励的比例和非比例合成钙染料加载细胞已被证明是一个可靠和灵活的工具来研究细胞内钙信号的各个方面。测量胞浆钙通量，使用这些技术相对比较简单。然而，测量使用rhod - 2和rhod - FF如合成钙指标的完整细胞intramitochondrial的钙离子水平，是更具挑战性。有针对性的线粒体合成的指标有减弱的反应在线粒体钙重复增加，破坏线粒体^形态 3 。此外，综合指标往往超过几个小时，这使得它们不适合用于长期实验泄漏线粒体。因此，根据基于绿色荧光蛋白^（GFP）4或有针对性的线粒体aequorin ⁵的基因编码的钙指标大大促进线粒体钙的动态测量。在这里，我们描述了一个简单的方法线粒体钙通量实时测量在不同的刺激的反应。该方法是基于“比例pericam'，这是选择性地针对线粒体的荧光显微镜。比率pericam是一种钙指标的基础上，融合的循环置换的黄色荧光蛋白和^钙调蛋白4。钙的比例pericam结合导致其激发峰从415纳米到494纳米的转变，而发射光谱，其中峰515纳米左右，保持不变。成比例pericam绑定一个单一的钙离子的解离常数在体外〜1.7 ^微米 4 。比例pericam这些属性允许线粒体钙离子浓度的快速和长期的变化进行量化。此外，我们描述了这种方法的适应，以一个标准的宽视场的钙成像显微镜用普通的过滤器设置。使用两种不同的受体激动剂，嘌呤受体激动剂ATP和凋亡诱导药物星形孢菌素，我们展示了几秒钟到几小时的时间分辨率监测线粒体钙离子浓度的变化，这种方法是适当的。此外，我们还证明，比例pericam也是用于测量/细胞凋亡过程中线粒体裂变碎片。因此，pericam比例是特别适合长期连续的细胞凋亡过程中线粒体钙的动态测量。

1。 Pericam - MT转染和细胞制备。

1. 无菌玻璃盖玻片放置在一个标准的6孔培养板转板的HeLa细胞的前一天晚上。
2. 2000年DNA /脂质体复合物准备，制造商（Invitrogen）的建议。我们使用比例pericam - MT的表达载体的4微克和10μL0.5毫升OPTI - MEM稀释为每口井的脂质体2000。细胞转染前〜70％融合。
3. 在每孔1.5毫升不含抗生素的同一媒体更换HeLa细胞培养基（贝科的修改鹰中等，10％胎牛血清，青霉素/链霉素）。
4. 新增，每孔转染的DNA /脂质体复合物。在^37℃，5％的CO ₂混合轻轻摇晃，4个小时，在细胞培养孵化器的孵化。
5. 更换与使用抗生素的培养基抗生素的自由媒体。允许细胞表达成像前1-2天的比例pericam。

2。显微镜设置和图像采集

1. 与HeLa细胞的盖玻片放入成像解决方案的合适的成像室：107毫米氯化钠，氯化钾7.2mM，1.2MM MgCl ₂的_，1MM氯化钙，11.5mm的葡萄糖，0.1％牛血清白蛋白和7.2 20MM HEPES 。我们的实验室使用Attofluor细胞室自Invitrogen。安装在倒置显微镜下阶段的成像室。
2. 查找包含一个或多个细胞表达比例pericam使用一个40X（或更高）油浸物镜的利益区域。我们发现，比例pericam抗性较差，在380 nm漂白，因此，我们使用这个波长物色合适的细胞。在图1中获得的图像，Superfluor尼康40X目标与1.3数值孔径。高倍率的目标也将是适当的（60 - 100X）。激励过滤器使用的色度科技滤波器D380/30x（380 + / - 30纳米）和D495/10（495 + / - 5纳米），分光镜505DCXR（505nm长波），发射滤波器HQ535/50m（535 + / - 25纳米）。
   我们的显微镜，用来获取的图像，在图1包括一个尼康TE2000倒置一个罗珀科学Coolsnap总部Ludl MAC6000快速滤光轮和转换器，CCD摄像头，冷却和MetaFluor数据采集和分析软件配备显微镜。适当的过滤器，能够捕获和处理的比例图像的软件，该协议可以适应任何标准的宽视场显微镜。
3. 成立了软件使用的495和380 nm的过滤器的双激发。钙结合比例pericam的增加在495 nm处的吸光度，从而比例应设立495 nm/380 nm的。
   成比例pericam钙自由激发峰在415 nm处^4。在这个协议中，我们建议使用380纳米过滤器，不仅因为它是无处不在大多数钙成像实验室。如果一个410纳米过滤器是可用的，最好是到380纳米过滤。
4. 获取图像顺序由另外495和380 nm的激动人心的。收购前至少30小号激动剂的应用程序通过灌注仪器基线钙水平的图像。马克除了为每个激动剂时间。曝光时间和采集时间间隔应进行优化，以防止漂白，同时仍然允许足够的时间resolution.For例如钙激动剂刺激半快速监测动态，被收购，图像每两秒钟，在图1b和C。快得多的数据采集速率也有可能^6。长期成像后星形孢菌素管理是一个较长的时间间隔（30岁）（图1 D和E）之间的收购与收购。

3。图像处理和分析

1. 一旦实验完成后，获得的图像可进行离线分析。定义的感兴趣区域（ROI），在您要监视的钙离子水平的变化。使用该领域的空白区域内的投资回报率减去背景，如果有必要选定一个。应该指出，线粒体是相当运动型和动态，并推断长时间，在一个单一的线粒体事件并不总是可能的。因此，考虑到这种细胞器在某些类型的细胞的高活力，投资回报率的选择应仔细监测。此外，在图1中可见一斑，线粒体响应不均匀各种刺激。因此重要的是离线数据分析和监控RO1的上一帧帧的基础上的位置。测量高度能动的线粒体线粒体钙的一个详细描述已在^别处 7 。
2. 从投资回报率获得比测量可以导入到Excel或类似graphingsoftware。数据可以作为一个代表在一个单细胞或单细胞线粒体的线粒体钙水平的变化进行的跟踪，或平均FL从几个投资回报率的uorescence信号。我们也使用了这种技术来衡量线粒体钙的水平，平均人口接受由Fas配^体 8诱导细胞凋亡的淋巴细胞。

4。代表性的成果：

图1。 （一）亚细胞定位比率pericam - MT。这第一个图像显示生活的HeLa细胞表达的比例，pericam - MT。第二个图像显示与线粒体选择性染料MitoTracker红CMXRos荧光染色。在合并后的图像的黄色荧光显示比例pericam - MT和MitoTracker荧光共定位。，（B）系列伪比率（495:380纳米）4 HeLa细胞的图像，表达MT - 10毫米ATP治疗的比例pericam （C）（二）与10毫米ATP治疗（D）系列伪比例（495:380纳米）MT一个HeLa细胞表达细胞的图像量化的感兴趣区域（ROI）的线粒体钙水平的变化表示比例pericam采用0.5微米的星形孢菌素。个别线粒体钙反应的异质性是显而易见的，以及60分钟线粒体显着的碎片。一些线粒体钙（白色箭头头）振荡上升，而其他不显示钙离子水平的显着变化（黄色箭头头）（E）在全球在一个单一的HeLa细胞的线粒体中钙的含量增加后，诱导细胞凋亡的量化0.5微米星形孢菌素。

在这里，我们提出了一个非常简单的方法测量线粒体钙线粒体有针对性的比例pericam。如图1a所示，使用标准广角光学没有去卷积，它可以轻松地查看个人线粒体在HeLa细胞中可以接受的信号噪声比。这是因为HeLa细胞，如文化中的大多数细胞，扁平化，大大壁时无须共聚焦显微镜或其他专用设备的需要。我们坚持多聚赖氨酸涂层的盖玻片的Jurkat细胞中发现了类似的结果。对比方法，使用的染料，它也有可能使用比例pericam（图1E），如基因编码的钙指标的小时线粒体钙的水平，非侵入性的监测。分析线粒体钙在细胞死亡时，这一点尤为重要。此外，它也可以可视化在细胞凋亡过程中线粒体的裂变/碎片。如在图1D和E所示，星形孢菌素治疗增长缓慢导致线粒体该峰的选择亚群在20分钟中的钙。钙水平下降，在治疗2小时后再次前再次与线粒体碎片伴随。这是与星形孢菌素测量治疗使用FURA - 2 ⁹诱导的胞浆钙的慢波相一致。因此，这是不符合聘用静态测量的方法，可以得到重要的动力学信息。虽然我们提出的比率和图1中的钙离子浓度，它是可以就地校准的传感器来计算绝对钙^的水平 ， 10。一个重要的需要考虑的是，比例pericam敏感，pH ^值4，10 。由于胞质和线粒体pH值可以改变¹¹细胞凋亡过程中显着，这是一个重要的考虑因素。在孤立的线粒体表达pericam中的pH值滴定^表明 ，[H +]的增加排放的pericam兴奋时在495 nm的激发在410 nm，已利用的一个属性，同时测量两个线粒体钙的受激发射的影响不大， pH值^12。因此，有选择性地监测与410 nm激发的排放提供了一种非ratiometrically显示器线粒体钙与pH值的降低关注。最后，这里介绍的协议，只需要访问一个广泛使用的过滤器的标准啶显微镜，从而使这项技术访问大多数实验室。

没有利益冲突的声明。

我们要感谢为我们提供的比例，pericam MT的表达构建宫胁淳。这项工作是支持的美国国立卫生研究院（DB）的赠款GM081685。

1. Berridge, M. J., Lipp, P. & Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol 1, 11-21 (2000).
2. Hajnoczky, G. et al. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca²⁺ uptake in apoptosis. Cell Calcium 40, 553-60 (2006).
3. Fonteriz, R. I. et al. Monitoring mitochondrial [Ca(2+)] dynamics with rhod-2, ratiometric pericam and aequorin. Cell Calcium 48, 61-9.
4. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S. & Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca²⁺. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 3197-202 (2001).
5. Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M. & Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca²⁺ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature 358, 325-7 (1992).
6. Miyawaki, A. et al. Fluorescent indicators for Ca²⁺ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388, 882-7 (1997).
7. Shimozono, S. et al. Confocal imaging of subcellular Ca²⁺ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE 2002, pl4 (2002).
8. Wozniak, A. L. et al. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol 175, 709-14 (2006).
9. Boehning, D. et al. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol 5, 1051-61 (2003).
10. Csordas, G. et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell 39, 121-32 (2010).
11. Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y. & Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol 2, 318-25 (2000).
12. Jiang, D., Zhao, L. & Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca²⁺/H+ antiporter. Science 326, 144-7 (2009).

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