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 JoVE Bioengineering

प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के अनुनाद और स्वतःस्फूर्त रमन microspectroscopy में अस्वीकृति

*1, *1, 1, 1,2

1Center for Biophotonics Science and Technology, University of California, Davis, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of California, Davis

* These authors contributed equally

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Cite this Article: प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के अनुनाद और स्वतःस्फूर्त रमन microspectroscopy में अस्वीकृति

Smith, Z. J., Knorr, F., Pagba, C. V., Wachsmann-Hogiu, S. Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy. J. Vis. Exp. (51), e2592, doi:10.3791/2592 (2011).

Abstract: प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के अनुनाद और स्वतःस्फूर्त रमन microspectroscopy में अस्वीकृति

रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी अक्सर एक मजबूत फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि से त्रस्त है, विशेष रूप से जैविक नमूनों के लिए. यदि एक नमूना ultrafast दालों, एक प्रणाली है कि अस्थायी spectrally अलग एक picosecond पर संकेतों अतिव्यापी कर सकते हैं timescale को अलग कर सकते हैं की एक ट्रेन के साथ उत्साहित है तुरंत रमन देर से पहुंचने प्रतिदीप्ति प्रकाश से प्रकाश में बिखरे हुए आ. यहाँ हम एक जटिल nonlinear ऑप्टिकल प्रणाली है कि एक कम बिजली ऑप्टिकल केर गेट के रूप में सभी ऑप्टिकल स्विचन का उपयोग करता रमन और प्रतिदीप्ति संकेतों को अलग करने का निर्माण और संचालन पर चर्चा की. बिजली की औसत और 80 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर के 2.4 डब्ल्यू के साथ एक एकल 808 एनएम लेजर, 808 एनएम <404 एनएम नमूना भेजा रमन प्रकीर्णन उत्तेजित प्रकाश के 5 मेगावाट करने के लिए परिवर्तित किया जा रहा है प्रकाश के लगभग 200 मेगावाट के साथ विभाजित है. बेबदल 808 एनएम प्रकाश शेष तो एक nonlinear माध्यम है जहां यह सभी ऑप्टिकल शटर के लिए पंप के रूप में कार्य करता है के लिए भेजा है. शटर खुलता है और बंद कर देता है लगभग 5% की एक चोटी दक्षता के साथ 800 एफएस में. इस प्रणाली का प्रयोग हम सफलतापूर्वक एक 80 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर पल्स ऊर्जा और औसत अधिकार है कि biologically सुरक्षित रहने का उपयोग रमन और प्रतिदीप्ति संकेतों को अलग करने में सक्षम हैं. क्योंकि इस प्रणाली ऑप्टिकल शक्ति के मामले में कोई अतिरिक्त क्षमता है, हम विस्तार डिजाइन और संरेखण में कई विचार है कि प्रणाली के throughput को अधिकतम करने में सहायता. हम भी केर माध्यम के भीतर स्थानिक और लौकिक संकेत और पंप बीम के ओवरलैप करते हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वर्णक्रमीय अधिग्रहण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए हमारी प्रोटोकॉल पर चर्चा की. अंत में, हम रमन स्पेक्ट्रा के कुछ प्रतिनिधि परिणाम मजबूत हमारे समय gating प्रणाली का उपयोग कर प्रतिदीप्ति की उपस्थिति में प्राप्त रिपोर्ट.

Protocol: प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के अनुनाद और स्वतःस्फूर्त रमन microspectroscopy में अस्वीकृति

1. कुछ देखभाल की तैयारी और इस प्रणाली के भीतर रखने रमन नमूना में लिया जाना चाहिए.

  1. क्योंकि इस प्रणाली आम तौर पर बहुत ही कम काम दूरी के साथ बहुत ही उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों की उपयोग करता है, नमूने coverslip पर रखा जाता है. जैविक नमूने आम तौर पर एक नंबर 1 मोटाई एक Attofluor सेल कक्ष (Invitrogen, Carlsbad, CA) में रखा coverslip पर रखा जाता है.
  2. तरल नमूने, विशेष रूप से उन मनुष्य के लिए विषाक्त है, एक एक सिलिकॉन epoxy के माध्यम से खोलने के लिए पुख्ता coverslip के साथ एक छोटे कांच की बोतल में रखा जाता है. बोतल तो माप के लिए उलटा है.
  3. क्योंकि हमारा सिस्टम पंप और संकेत दालों के सटीक समय पर निर्भर करता है, हम हमारे सूक्ष्मदर्शी की पारंपरिक ध्यान समायोजन, जो उद्देश्य तब्दील ऊपर और नीचे का उपयोग नहीं करने के लिए विवश हैं. यह कहते हैं और हमारे सिस्टम से ऑप्टिकल पथ घटाता है. इसके बजाय, हम एक माध्यमिक खुर्दबीन मंच है कि अपनी स्वतंत्र ध्यान केंद्रित नियंत्रण के शीर्ष पर घुड़सवार मंच पर हमारे नमूने जगह है.

2. आदेश में लेने के लिए समय gated रमन स्पेक्ट्रा, उत्तेजना बीम ठीक से तैयार रहना चाहिए.

  1. Sapph लेजर (गिरगिट, सुसंगत सिस्टम, सांता क्लारा, CA): हम एक 2.4 डब्ल्यू tunable स्पंदित तिवारी से उभरते प्रकाश के साथ शुरू करते हैं. 80 मेगाहर्टज पल्स ट्रेन में प्रत्येक नाड़ी ऊर्जा के 30 NJ, 140 एफएस की एक अस्थायी चौड़ाई है, और एक ~ 6 एनएम के एक वर्णक्रमीय बैंडविड्थ के साथ 808 एनएम पर केंद्रित स्पेक्ट्रम है.
  2. लेजर गुहा पुनः प्रवेश से बैक - प्रतिबिंब को रोकने के लिए, प्रकाश एक फैराडे अलगाने के माध्यम से पारित कर दिया है. एक आधे लहर फैराडे अलगाने से पहले रखा थाली कुल प्रणाली में भेजा सत्ता के निरंतर ट्यूनिंग की अनुमति देता है.
  3. क्योंकि 6 एनएम भी एक व्यापक सबसे रमन मोड को हल करने के लिए बैंडविड्थ है, बीम एक बहुत ही संकीर्ण bandpass (0.8 एनएम FWHM, Andover निगम, सेलम, एनएच) 808 एनएम पर केंद्रित फिल्टर के माध्यम से भेजा है.
  4. प्रकाश तो एक 5 मिमी β बेरियम (BBO) borate क्रिस्टल (CASIX, फ़ूज़ौ, फ़ुज़ियान, पीआर चीन) 404 एनएम के लिए 808 एनएम से तरंगदैर्ध्य आधा पर एक अवर्णी नक़ल (च मिमी = 100) के द्वारा ध्यान केंद्रित है. BBO क्रिस्टल टिप और झुकाव नियंत्रण के साथ माउंट में रखा है, और भी अनुवाद मंच पर घुड़सवार. तरंगदैर्ध्य रूपांतरण की क्षमता को अधिकतम करने के लिए, क्रिस्टल नक़ल के ध्यान के बारे में ठीक सममित रखा होना चाहिए, और के साथ अपने क्रिस्टल अक्ष आने वाली किरण के ध्रुवीकरण के लिए गठबंधन.
  5. क्योंकि तरंगदैर्ध्य रूपांतरण की क्षमता पर निर्भर ध्रुवीकरण है, नमूना भेजा प्रकाश की मात्रा पर नियंत्रण फैराडे अलगाने के बाद एक दूसरे आधे लहर थाली रखकर प्राप्त किया जा सकता है. इस waveplate घूर्णन नमूना भेजा प्रकाश की तीव्रता पंप बीम (नीचे चर्चा) में भेजा तीव्रता के स्वतंत्र रूप से समायोजित किया जा सकता है.
  6. तरंगदैर्ध्य - परिवर्तित प्रकाश एक दूसरा अवर्णी (च मिमी = 500) नक़ल ऐसी कि बाहर निकलने बीम काफी बड़े खुर्दबीन उद्देश्य के पीछे एपर्चर को भरने, और एक औंधा माइक्रोस्कोप (IX-71, ओलिंप में निर्देशित है चुना द्वारा recollimated है, केंद्र घाटी, फिलीस्तीनी अथॉरिटी दो स्टीयरिंग दर्पण के माध्यम से).
  7. खुर्दबीन उद्देश्य, ऑप्टिकल प्रणाली के सबसे अखंड घटक के भीतर रखे तत्व जा रहा है, ऑप्टिक अक्ष को परिभाषित करता है. उत्तेजना बीम इस अक्ष को संरेखित करने के लिए, एक दर्पण खुर्दबीन के नमूने विमान में रखा गया है. दो स्टीयरिंग दर्पण तो iteratively देखते हैं जबकि एक सीसीडी कैमरा (μEye, आईडी, Obersulm, जर्मनी) - युग खुर्दबीन इमेजिंग के बंदरगाह के लिए संलग्न पर वापस परिलक्षित लेजर बीम देख. यह मानते हुए कि कैमरे पर छवि खुर्दबीन क्षेत्र के देखने पर केंद्रित है, बीम-अक्ष पर जब फोकल हाजिर खुर्दबीन चिप और उद्देश्य की z-अक्ष के साथ अनुवाद पर केंद्रित है केंद्र बिंदु को बदल नहीं है defocused बीम.
  8. जब एक नमूना नमूना विमान में रखा है और साथ विकिरणित लेज़र प्रकाश रमन प्रकीर्णन होता है. एक dichroic उद्देश्य खुर्दबीन के नीचे रखा फिल्टर तरंगदैर्ध्य उत्तेजना बीम से स्थानांतरित कर दिया रमन बिखरे हुए प्रकाश (और प्रतिदीप्ति) अलग, माइक्रोस्कोप की ओर बंदरगाह के लिए रमन बिखरे हुए प्रकाश निर्देशन. खुर्दबीन के लिए इस पथ के भीतर किसी भी लेंस, जैसे कि संकेत प्रकाश collimated खुर्दबीन से उभर निकालने के लिए संशोधित किया गया था.
  9. क्योंकि संकेत बीम खुर्दबीन से उभरते Glan-Thompson polarizers के स्पष्ट एपर्चर की तुलना में बड़ा है, एक 0.47x दूरबीन दो अवर्णी दोहरी (f1 = 75 मिमी, F2 = 35 मिमी) का निर्माण किया है बीम हटना करने के लिए इस्तेमाल किया.
  10. संकेत प्रकाश तो 0 ° पर Glan Thompson प्रयोगशाला फ्रेम में खड़ी करने के लिए सम्मान के साथ उन्मुख polarizer द्वारा polarized, और जहां यह पंप बीम के साथ recombined है dichroic दर्पण करने के लिए निर्देशित है.

3. चोटी कार्यकुशलता पर काम ऑप्टिकल फाटक के लिए आदेश में, देखभाल पंप (केर बीम) के रूप में अच्छी तरह से बीम की तैयारी में लिया जाना चाहिए.

पंप नाड़ी पहले दो अवर्णी दोहरी (f1 = 35 मिमी, F2 = 100 मिमी) के साथ निर्माण करने के लिए संकेत बीम के अंतिम आकार मैच दूरबीन के साथ 0.35x द्वारा बढ़ाया.
  • पंप बीम तो एक सही कोण एक रेखीय अनुवाद मंच है कि पंप और संकेत दालों (नीचे चर्चा की ट्यूनिंग) के अस्थायी ओवरलैप को सुनिश्चित करने के लिए tuned किया जा सकता है पर रखा चश्मे से बना देरी लाइन में भेजा जाता है.
  • विलंब लाइन के बाद, बीम एक थाली आधे लहर polarizer और उन्मुख के माध्यम से 45 ° पर भेजा जाता है प्रयोगशाला फ्रेम में खड़ी करने के लिए सम्मान के साथ. इस पंप बीम की उचित ध्रुवीकरण राज्य सुनिश्चित करता है जब यह nonlinear मध्यम तक पहुँचता है.
  • प्रकाश तो दो स्टीयरिंग दर्पण, एक piezo विद्युत नियंत्रण के साथ, कि पतले पंप बीम की स्थिति को समायोजित करने के लिए उपयोग किया जाता है के बंद परिलक्षित जैसे कि संकेत किरण के साथ यह spatially overlaps. ओवरलैप और दो स्थानों, एक को बंद करने और dichroic दर्पण जहां मुस्कराते हुए संयुक्त कर रहे हैं से दूर एक पंप संकेत मुस्कराते हुए देख के द्वारा प्राप्त की है. पहले स्टीयरिंग दर्पण का उपयोग करने के लिए निकट इंगित करें, और दूर बिंदु पर मुस्कराते हुए ओवरलैप piezo दर्पण पर दो बीम ओवरलैप, पंप किरण संकेत किरण के साथ बिल्कुल समरेख हो किया जा सकता है.
  • साथ दो मुस्कराते हुए संयुक्त केर गेट और संग्रह प्रणाली स्थापित करने के लिए एकत्र समय gated संकेत को अधिकतम.

    • 4. साथ दो मुस्कराते हुए संयुक्त केर गेट और संग्रह प्रणाली स्थापित करने के लिए एकत्र समय gated संकेत को अधिकतम.

    1. पंप और संकेत मुस्कराते हुए पहले एक dichroic फिल्टर है कि 404 एनएम 6 के एक आयुध डिपो nonlinear मध्यम भीतर रोमांचक रमन प्रकीर्णन से किसी भी अवशिष्ट उत्तेजना प्रकाश को रोकने के माध्यम से पारित कर रहे हैं.
    2. पंप और संकेत मुस्कराते हुए तो दोनों एक 1 सेमी pathlength क्वार्ट्ज nonlinear सामग्री युक्त क्युवेट में एक अवर्णी नक़ल (च मिमी = 35) के द्वारा ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. यहाँ कोई nonlinear सामग्री, एक उपयुक्त उच्च nonlinear सूचकांक (दो सीएस से अधिक), और उपयुक्त कम अस्थायी प्रतिक्रिया (<2 पी एस) होने का उपयोग किया जा सकता है . इन प्रयोगों के लिए, हम कार्बन डाइसल्फ़ाइड, सीएस 2, कि एक nonlinear सूचकांक 2 n = 3.1 -18 10 x 2 मीटर / डब्ल्यू का उपयोग करें प्रकाश तो एक केन्द्र पहले से समान लंबाई के साथ एक दूसरे नक़ल द्वारा recollimated है.
    3. मुस्कराते हुए तो के माध्यम से पारित कर रहे हैं और एक rotating माउंट पर Glan-Thompson विश्लेषक, और फिर अवशोषण और हस्तक्षेप फिल्टर है कि संयुक्त 808 एनएम पर एक 10 के आयुध डिपो के एक सेट के माध्यम से.
    4. अंत में, संकेत प्रकाश एक 50 सुक्ष्ममापी बहुपद्वति ऑप्टिकल फाइबर, जहां फाइबर है कि एक्स, वाई, जेड और में अनुवाद की अनुमति देता है एक मंच में मुहिम शुरू की है में एक अवर्णी नक़ल (च मिमी = 35) के द्वारा ध्यान केंद्रित है फाइबर तो संलग्न सीसीडी कैमरा (SP2300i और Pixis 100B, क्रमशः, दोनों द्वारा निर्मित प्रिंसटन उपकरण, ट्रेंटन, न्यू जर्सी) के साथ एक वाणिज्यिक इमेजिंग spectrograph के लिए युग्मित है.
    5. संग्रह करने के लिए एकत्र संकेत को अधिकतम प्रणाली संरेखित करने के लिए, विश्लेषक 0 पर सेट है ° और टोल्यूनि के एक परीक्षण नमूना नमूना विमान में रखा है. एक्स, वाई, और फाइबर माउंट के z नियंत्रण का समायोजन करके, रमन संकेत एकत्र अनुकूलित है.
    6. पंप और संकेत बीम के उचित स्थानिक और लौकिक ओवरलैप सुनिश्चित करने के लिए, एक दर्पण खुर्दबीन के नमूने विमान में रखा गया है. 404 एनएम फिल्टर प्रणाली से हटा दिया जाता है. साथ विश्लेषक 90 को घुमाया ° retroreflected 404 एनएम बीम spectrograph में ऐसी है कि यह कैमरा तर नहीं करता समायोजित तीव्रता के साथ भेजा जाता है. पंप बंद बीम के साथ, विश्लेषक प्रेषित 404 एनएम संकेत को कम करने के लिए घुमाया है. पंप बीम के साथ वापस कर दिया, देरी मंच धीरे धीरे जब तक 404 एनएम के प्रकाश के संचरण को बढ़ाने के लिए शुरू होता है देखते है. फिर, iteratively द्वारा देरी चरण piezo बिजली, दर्पण ट्यूनिंग, और एक्स, वाई, और फाइबर की z नियंत्रण, एक संकेत अधिकतम है.
    7. क्योंकि 404 एनएम बीम और रमन बिखरे हुए प्रकाश प्रणाली के माध्यम से थोड़ा अलग अलग रास्तों ले सकता है रेट्रो परिलक्षित, अंतिम समायोजन नमूना मंच और थोड़ा tweaking के संरेखण पर बदलने के द्वारा एक मजबूत रमन scatterer (जैसे कि टोल्यूनि के रूप में) रखकर बना रहे हैं देरी मंच, piezeo बिजली दर्पण, और फाइबर के एक्स, y, और z नियंत्रण रमन संकेत का अनुकूलन करने के लिए.

    5. किसी एकल समय gated रमन स्पेक्ट्रम का संग्रह कई स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण प्रणाली कलाकृतियों के लिए सही करने की आवश्यकता है है.

    1. साथ विश्लेषक 0 °, उत्तेजना पर बीम और पंप बीम बंद करने के लिए सेट, एक "ungated" स्पेक्ट्रम लिया है, स्पेक्ट्रम कि समय gating प्रणाली के लाभ के बिना हासिल होगा का प्रतिनिधित्व.
    2. साथ विश्लेषक 90 °, उत्तेजना बीम और पंप किरण अभी भी बंद करने के लिए सेट, एक स्पेक्ट्रम वापस जमीन ले लिया है, आवारा प्रकाश polarizers प्रणाली में और अन्य तत्वों के माध्यम से लीक की राशि का प्रतिनिधित्व.
    3. के साथ 90 पर शेष विश्लेषक °और पर सभी मुस्कराते हुए, "gated" स्पेक्ट्रम लिया है, रमन बिखरे हुए पंप बीम की उपस्थिति द्वारा को पार कर polarizers के माध्यम से की अनुमति प्रकाश का प्रतिनिधित्व.
    4. अंत में, पर अभी भी 90 ° विश्लेषक के साथ, उत्तेजना बंद बीम और पंप पर बीम, एक दूसरा पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम लिया है, 808 एनएम spectrograph में प्रवेश प्रकाश की अवशिष्ट मात्रा के "gated" स्पेक्ट्रम के लिए योगदान का प्रतिनिधित्व.
    5. इसके अतिरिक्त, एक स्पेक्ट्रम सभी बंद लेज़रों के साथ लिया जाता है, आधारभूत "अंधेरे" कैमरा और इलेक्ट्रॉनिक्स के संकेत स्तर निस्र्पक.
    6. क्योंकि स्पेक्ट्रा अक्सर लंबा एकीकरण समय की आवश्यकता होती है, यह जरूरी है कई टुकड़े (फ्रेम) में इस एकीकरण के समय को तोड़ने के लिए ब्रह्मांडीय किरणों की उचित सुधार के लिए अनुमति देते हैं - एक आम समस्या है जब कई मिनट के spans पर डेटा प्राप्त.

    6. एक बार हासिल कर ली, कई प्रसंस्करण कदम गुणवत्ता और डेटा की उपस्थिति में सुधार करने के लिए सहायक होते हैं.

    1. सबसे पहले, सभी स्पेक्ट्रा अंधेरे "अंधेरे" स्पेक्ट्रम subtracting द्वारा सही कर रहे हैं.
    2. ब्रह्मांडीय किरणों के लिए सही करने के लिए, कई फ्रेम एक अधिग्रहण का गठन एक पिक्सेल द्वारा पिक्सेल के आधार पर एक दूसरे से तुलना कर रहे हैं. किसी भी फ्रेम है कि सभी फ्रेम के पार है कि पिक्सेल के लिए औसत मूल्य से 2 औसत विचलन के बाहर गिर जाता है की किसी भी पिक्सेल के लिए, कि पिक्सेल मूल्य सभी तख्ते भर में औसत मूल्य के द्वारा बदल दिया है.
    3. ब्रह्मांडीय रे सही फ्रेम तो कर रहे हैं और औसतन एक Savitzky Golay एक फिल्टर द्वारा smoothed है .
    4. "सच" gated स्पेक्ट्रम निकालने के लिए, हम "उत्तेजना के केवल" और घटाना "केवल पंप" मापा gated स्पेक्ट्रम से स्पेक्ट्रा.
    5. अंत में, gated और ungated स्पेक्ट्रा तो एक 5 वें क्रम बहुपद, Lieber और महादेवन - Jansen 2 के पद्धति का उपयोग करके निर्धारित subtracting द्वारा सही पृष्ठभूमि है.

    7. प्रतिनिधि परिणाम:

    चित्रा 1
    चित्रा 1. Kerr gating प्रणाली के योजनाबद्ध आरेख. पंप किरण पथ लाल रंग में दिखाया गया है, जबकि एसएचजी पथ नीले रंग में दिखाया गया है. पथ जहां रमन और प्रतिदीप्ति छा रहे हैं हरे रंग में दिखाया गया है, जबकि पथ जहां प्रतिदीप्ति अस्थायी बाहर फ़िल्टर्ड किया गया है पीले रंग में दिखाया गया है. लघुरूप के रूप में: बीपीएफ, बैंड पास फिल्टर, सीसीडी, आरोप डिवाइस युग्मित, डीसीएम, dichroic दर्पण, वित्तीय संस्था, फैराडे अलगाने; λ / 2, आधे लहर थाली, LPF, लंबे समय से पास फिल्टर, एनएलएम, nonlinear मध्यम, पी polarizer, एसएचजी, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी क्रिस्टल.

    चित्रा 2
    चित्रा 2: विसर्जन के तेल में भंग coumarin के कच्चे स्पेक्ट्रा. लाल वक्र खुला आयोजित गेट (विश्लेषक अधिकतम संचरण के लिए सेट) के साथ लिया स्पेक्ट्रम से पता चलता है. काले वक्र स्पेक्ट्रम विश्लेषक न्यूनतम पारेषण और एक पंप किरण लागू (gated स्पेक्ट्रम) के लिए गठबंधन के साथ लिया से पता चलता है. ब्लू वक्र न्यूनतम पारेषण और कोई पंप किरण लागू के लिए गठबंधन विश्लेषक के साथ लिया spectum (गेट आयोजित बंद) से पता चलता है. ग्रीन वक्र साथ ही पंप किरण लागू किए गए स्पेक्ट्रम से पता चलता है. डैश्ड मैजंटा लाइनों वर्णक्रमीय पैनल में नीचे दिखाया गया क्षेत्र से संकेत मिलता है. सभी स्पेक्ट्रा एक 11 बिंदु, 3 क्रम Savitzky Golay फिल्टर के साथ smoothed किया गया है. नीचे: coumarin के स्पेक्ट्रा प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि घटाव के बाद विसर्जन के तेल में भंग. Red अवस्था है फाटक के साथ स्पेक्ट्रम खुला आयोजित किया है, और नीले रंग की वक्र gated स्पेक्ट्रम है. gated स्पेक्ट्रम स्पष्ट रूप से जटिल उच्च wavenumber तेलों के शिखर विशेषता से पता चलता है.

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    Discussion: प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के अनुनाद और स्वतःस्फूर्त रमन microspectroscopy में अस्वीकृति

    बायोमेडिकल रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के क्षेत्र में पिछले कई वर्षों से अधिक जैविक निदान में कई कठिन चुनौतियों को हल करने के लिए अपने संभावित प्रदर्शन का एक परिणाम के के रूप में बढ़ती रुचि को देखा है. उदाहरण के लिए, रमन स्पेक्ट्रा के कैंसर का पता लगाने 3, 4, 5, 6 में नैदानिक ​​मूल्य है दिखाया गया है . रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी भी बैक्टीरियल quantitation 7, 8 और बैक्टीरियल दवा 9 प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया गया है . यह भी हड्डी स्वास्थ्य 10 से biofluid विश्लेषण 11, 12 को लेकर अन्य जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के एक विस्तृत रेंज में आवेदन पाया.

    इसकी बेहद कमजोर पार अनुभाग: ऐसे महान क्षमता के बावजूद, तथापि, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी सबसे जैविक प्रणालियों में से अधिक - आते एक बड़ी बाधा है. इसलिए, रमन संकेतों को आसानी से भी काफी मामूली फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि द्वारा अभिभूत किया जा सकता है. कई तकनीक प्रतिदीप्ति lineshape 2, 13, 14 को हटाने के लिए मौजूद हैं. हालांकि, इन तकनीकों में से कोई भी वास्तव में मजबूत पृष्ठभूमि के साथ फ्लोरोसेंट मुख्य मुद्दे को संबोधित, शॉट शोर फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि रमन संकेत पड़ा की उपस्थिति द्वारा स्पेक्ट्रम के लिए योगदान और दूर घटाया नहीं जा सकते हैं. सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन (कारों) स्पेक्ट्रोस्कोपी और उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (या व्युत्क्रम रमन प्रकीर्णन) जैसे कई तकनीकों, रमन संकेत 15, 16, 17 की ताकत बढ़ाना करने का प्रयास करने के लिए विकसित किया गया है. हालांकि, इन तकनीकों के सभी मुख्य रूप से पारदर्शी नमूनों के लिए लागू कर रहे हैं और अपने स्वयं के पृष्ठभूमि और रासायनिक 18 संवेदनशीलता के साथ समस्याओं है.

    प्रतिदीप्ति संकेत से बचाते डिटेक्टर केवल करने के लिए वास्तव में शॉट सहज रमन प्रकीर्णन में प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के साथ जुड़े शोर अस्वीकार तरीका है. से अधिक एक दशक पहले, Matousek एट अल. प्रतिदीप्ति एक ultrafast केर शटर का उपयोग करने के लिए अस्थायी रमन और प्रतिदीप्ति 19 का संकेत है, 20 अलग अस्वीकृति का प्रदर्शन किया. हालांकि, तिथि करने के लिए इस प्रणाली जैविक जरूरत से ज्यादा उच्च पल्स ऊर्जा के लिए की जरूरत की वजह से क्षेत्र में बड़े पैमाने पर उपयोग नहीं पाया गया है. इस संचार में प्रस्तुत प्रणाली, इसके विपरीत द्वारा, 1000 बार कमजोर कुछ पिछली रिपोर्टों से पल्स ऊर्जा का इस्तेमाल करता है और जैविक प्रणालियों के साथ संगत है.

    हमारी प्रणाली, चित्रा 1 में दिखाया गया है एक समरेख केर फाटक के सत्ता के संरक्षण और और संभव के रूप में nonlinear मध्यम भीतर पंप संकेत बीम के बीच के रूप में ज्यादा के ओवरलैप प्रदान ज्यामिति का इस्तेमाल. इसके अलावा, हम देखभाल करने के लिए के रूप में ज्यादा के रूप में संभव ऑप्टिकल घाटे को कम करने के लिए सुनिश्चित करें कि हम अधिकतम उपलब्ध करने के लिए हमारी केर शटर संचालित शक्ति है. हम अत्यधिक जैविक नमूने, अर्थात् एक जैस्मीन संयंत्र स्टेम fluorescing के रमन स्पेक्ट्रा प्राप्त किया है, किसी भी photodamage 21 के प्रेक्षण के बिना, इस प्रणाली का उपयोग करना. इस रिपोर्ट में हम एक मॉडल प्रणाली पर आधारित एक संयंत्र की fluorophore कुछ प्रतिनिधि डेटा (coumarin, τF एनएस 5 ≈) खुर्दबीन विसर्जन तेल में भंग दिखा. यह चित्रा 2 में दिखाया गया है. शीर्ष पैनल में, हम लाल रंग में मजबूत "ungated" स्पेक्ट्रम (0 ° करने के लिए सेट विश्लेषक) देखते हैं, दृश्य प्रयोजनों के लिए अधिकतम मूल्य का 0.04% करने के लिए बढ़ाया. ध्यान दें कि वहाँ कोई discernable रमन दिखाई चोटियों हैं. नीचे, काले रंग में, कच्चे gated स्पेक्ट्रम (दोनों पंप और पर पराबैंगनीकिरण उत्तेजना के साथ स्पेक्ट्रम यानी) है. नीचे है कि, नीले रंग में है, सिर्फ उत्तेजना पर लेजर, अवशिष्ट को पार कर polarizers के माध्यम से लीक प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करने के साथ स्पेक्ट्रम है. अंत में, हरे रंग में है, हम पंप लेजर अवशोषण और हस्तक्षेप प्रणाली में रखा फिल्टर के संयोजन के माध्यम से लीक की वजह से पृष्ठभूमि देखते हैं. 2 चित्रा के निचले पैनल में हम 5 क्रम बहुपद के घटाव के बाद ungated और gated स्पेक्ट्रम (ऊपरी पैनल में धराशायी मैजंटा लाइनों से चिह्नित क्षेत्र) के एक subregion देखते हैं. gated स्पेक्ट्रम स्पष्ट रूप से उच्च wavenumber लिपिड के साथ जुड़े चोटी से पता चलता है, जबकि ungated स्पेक्ट्रम कोई स्पष्ट रमन सुविधाओं है.

    हालांकि हमारी प्रणाली महान effciency के साथ वर्तमान में काम नहीं करता है (अधिकतम मापा संचरण 5% के आसपास किया गया है), निरपेक्ष सिग्नल की शक्ति आम तौर पर संकेत शोर से कम महत्वपूर्ण है. जैविक नमूने के कई व्यापक वर्ग जिसके लिए पारंपरिक रमन स्पेक्ट्रा को मापने या तो मुश्किल या अव्यावहारिक भारी प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के कारण है. इन नमूनों के लिए, हमारी प्रणाली एक निश्चित सुधार के संकेत करने वाली शोर प्रदान, चित्रा 2 के रूप में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है.

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    Disclosures: प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के अनुनाद और स्वतःस्फूर्त रमन microspectroscopy में अस्वीकृति

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Acknowledgements: प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के अनुनाद और स्वतःस्फूर्त रमन microspectroscopy में अस्वीकृति

    यह काम NSF पुरस्कार 0852891 DBI द्वारा वित्त पोषित किया गया था. इस काम का एक हिस्सा भी कैलिफोर्निया, डेविस के विश्वविद्यालय द्वारा सहकारी समझौते सं PHY0120999 के तहत, प्रबंधित Biophotonics विज्ञान और प्रौद्योगिकी, एक नामित NSF विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र के लिए केंद्र द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

    Materials: प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के अनुनाद और स्वतःस्फूर्त रमन microspectroscopy में अस्वीकृति

    Name Company Catalog Number Comments
    Lenses Thorlabs Inc. Various All lenses coated to have maximum transmission losses of 1% each
    Tunable Ti:Sapph laser Coherent Inc. Chameleon 30 nJ, 200 fs, 80 MHz
    40X oil immersion objective Olympus Corporation UApo/340 NA = 1.35
    Inverted microscope Olympus Corporation IX-71 Modified to remove all lenses in side port
    Half wave plate Thorlabs Inc. AHWP05M-600
    Glan-Thompson polarizer Thorlabs Inc. GTH10M ˜10% transmission loss
    Spectrometer Princeton Instruments/Acton SP2300i
    CCD Princeton Instruments/Acton Pixis 100B
    Mathmatical software Mathworks MATLAB version 2008a
    Faraday isolator EOT BB8-5I
    Piezo-electric mirror Newport Corp. AG-M100
    BBO crystal CASIX custom 1 mm thickness
    Bandpass filter 1 Andover 008FC14 808 0.4 nm
    Dichroic mirror Semrock FF662-FDI01 band edge at 662 nm
    Long-pass filter Semrock BLP01-405R band edge at 417 nm
    Bandpass filter 2 Semrock FF02-447/60 417-447 nm
    CS2 Sigma-Aldrich 335266 99% purity
    Coumarin 30 Sigma-Aldrich 546127 99% purity
    Immersion oil Cargill Labs 16242 Type DF

    References: प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के अनुनाद और स्वतःस्फूर्त रमन microspectroscopy में अस्वीकृति

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