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 JoVE Bioengineering

共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

*1, *1, 1, 1,2

1Center for Biophotonics Science and Technology, University of California, Davis, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of California, Davis

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Cite this Article: 共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

Smith, Z. J., Knorr, F., Pagba, C. V., Wachsmann-Hogiu, S. Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy. J. Vis. Exp. (51), e2592, doi:10.3791/2592 (2011).

Abstract: 共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

ラマン分光法は、多くの場合、特に生体試料のために、強い蛍光背景に悩まされている。サンプルは、超高速パルスのパルス列で励起されている場合は、時間的スケールピコ秒でのスペクトル重複する信号を分離できるシステムは、後着蛍光光源からのラマン散乱光を到着速やかに分離することができます。ここでは、ラマン及び蛍光信号を分離するために低消費電力光カーゲートの形で全光スイッチングを使用する複雑な非線形光学系の構築と運用について説明します。平均電力と80 MHzの繰り返し周波数の2.4 Wを持つ単一の808nmのレーザーは、ラマン散乱を励起するためにサンプルに送られた404 nmの光の<5 mWに変換される808 nmの光の約200 mWのと、分割されます。残りの未変換の808 nmの光は、それはすべての光シャッターのためのポンプとして機能する非線形媒質に送信されます。シャッターが開き、約5％のピーク効率は、800フェムト秒後終了。このシステムを用いて、我々は、正常にパルスエネルギーと生物学的に安全なままに平均電力を使用して80 MHzの繰り返し率でラマンと蛍光信号を分離することができます。システムは、光パワーの面では容量に余裕がないので、細部のいくつかのデザインと配置​​に関する考慮そのシステムのスループットを最大化を支援する。私達はまた私達のカー媒質内信号とポンプ光の空間的および時間的重なりを得るためのプロトコルだけでなく、スペクトル取得のための詳細なプロトコルを議論する。最後に、我々は時間ゲーティングシステムを使用して強い蛍光の存在下で得られたラマンスペクトルのいくつかの代表的な結果を報告する。

Protocol: 共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

1。いくつかの注意は、このシステム内でラマンサンプルを準備して置くことに注意する必要があります。

  1. システムは通常、非常に短い作動距離を持つ非常に高開口数の目標を使用しているため、サンプルはカバースリップ上に配置されます。生物学的サンプルは、典型的にAttofluorセル室（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）でマウントされている第1の厚さのカバースリップ上に配置されています。
  2. 特に液体試料、ヒトへの毒性それらは、シリコンエポキシの手段により、開口部に接合カバースリップの小さなガラスの瓶の中に配置されます。ボトルは、測定のために反転されます。
  3. 私たちのシステムは、ポンプと信号パルスの正確なタイミングに依存するため、我々は客観的に上下に変換する私たちの顕微鏡の従来のフォーカス調整を、使用しないように制限されます。これは私たちのシステムからの光路を追加し、減算。その代わりに、我々は独自の独立したフォーカス制御を持っている顕微鏡のステージの上部に取り付けられた第2段階で我々のサンプルを配置。

2。タイムゲートのラマンスペクトルを取るために、励起ビームが適切に準備する必要があります。

  1. Sapphレーザー（カメレオン、コヒーレントシステム、サンタクララ、カリフォルニア州）：我々は、2.4 WチューナブルパルスTiから新たな光で始まります。 80 MHzのパルス列の各パルスのエネルギーの30ニュージャージー州を持っている、140 fsの時間幅を持って、と〜6nmのスペクトル帯域幅を持つ808 nmの中心とするスペクトルを有する。
  2. レーザ共振器を再入力から後方反射を防ぐために、光は、ファラデーアイソレータを介して渡されます。ファラデーアイソレータの前に置かれた半波長板は、システムに送信された総電力の連続同調することができます。
  3. 6nmのは、ほとんどのラマンモードを解決するには余りにも広い帯域幅であるため、ビームは808nmのを中心とする非常に狭い（0.8 nmのFWHM、アンドーバーコーポレーション、セーラム、ニューハンプシャー州）バンドパスフィルタを介して送信されます。
  4. 光はその後、808 nmから404 nmの波長を半減さを5mmβ-バリウムホウ酸（BBO）結晶（CASIX、福州、福建省、PR中国）に色消し（F = 100 mm）と焦点を当てています。 BBO結晶は、先端とチルトのコントロールとマウントで配置され、また、翻訳の段階に搭載されている。波長変換の効率を最大化するために、結晶がダブレットの焦点について正確​​に対称に配置され、その結晶軸は、入射ビームの偏光に揃えられている必要があります。
  5. 波長変換の効率は偏光に依存するので、サンプルに送られた光の量の制御は、ファラデーアイソレータ秒後に半波長板を配置することによって得ることができます。この波長板を回転させることにより、サンプルに送信される光の強度は、独立してポンプビーム（後述する）で送信される強度の調整することができます。
  6. 波長変換光が出る光は顕微鏡対物レンズの背面開口部を埋めるのに十分な大きさになるように、と指示倒立顕微鏡（IX - 71、オリンパス、中に選択した第二色消し（F = 500 mm）とrecollimatedさtwoステアリングミラーによるセンターバレー、PA）。
  7. システムのほとんどのモノリシック構成要素の中に収容された光学素子である顕微鏡の目的は、光軸を定義しています。この軸に励起光を揃えるには、ミラーは、顕微鏡の試料面に配置されます。 CCDカム時代（μEye、IDS、Obersulm、ドイツ）顕微鏡のイメージングポートに接続された上でのバック反射されたレーザ光を観察しながら、2つのステアリングミラーは、その後、繰り返し調整されています。カメラの画像が顕微鏡の視野の中央にあると仮定すると、ビームは、焦点スポットがz -軸に沿って目的の顕微鏡のチップと翻訳を中心とする軸上の中心点を変更していないです。デフォーカスビームの。
  8. サンプルを試料面に配置し、照射するとレーザー光ラマン散乱が発生します。顕微鏡対物の下に置かれたダイクロイックフィルターは、顕微鏡のサイドポートにラマン散乱光を指示、励起光から波長シフトしたラマン散乱光を（および蛍光）を分離する。顕微鏡は、信号光は、コリメート顕微鏡から出ていることなど、このパス内の任意のレンズをはずしてするように変更されました。
  9. 顕微鏡から出てきた信号光は、グラントムソン偏光板の開口よりも大きいため、0.47x望遠鏡は、ビームを縮小するために使用されている2つの無色のダブレット（F1 = 75ミリメートル、F2 = 35 mm）の構築。
  10. 信号光は、研究室の枠の縦の方向に0 °で配向さグラントムソン偏光子によって偏光であり、そしてそれはポンプビームと再結合されたダイクロイックミラーに指示した。

3。ピーク効率で動作する光ゲートためには、注意が同様にポンプ光（カービーム）の準備に注意する必要があります。

ポンプパルスは、最初の信号ビームの最終的なサイズを一致させるには、2つ色消しダブレット（F1 = 35ミリメートル、F2 = 100 mm）で構成された望遠鏡で0.35xによって拡大されます。
  • ポンプビームは、（後述するチューニング）ポンプと信号パルスの時間的重複を確保するために調整することができる直線移動ステージ上に配置直角プリズムから構成されるディレイラインに送信されます。
  • ディレイラインの後、ビームは実験室の枠に垂直に対して45 °に配向半波長板と偏光板を介して送信されます。それは非線形媒質に達したときにこれはポンプビームの適切な偏光状態を保証します。
  • 光は、2つのステアリングミラー、細かく信号光と空間的にそれが重なるそのようなポンプのビームの位置を調整するために使用されるピエゾコントロールを持つ1つのオフ反映されます。オーバーラップは、2つの場所、一つの近くと遠くの梁が結合されるダイクロイックミラーから1つのポンプと信号光を観察することによって得られる。遠点でのビームのオーバーラップに近いポイントで2つのビームのオーバーラップする最初のステアリングミラーを使用して、そしてピエゾミラーによって、ポンプビームは、信号光と正確に一直線上にすることができます。
  • 結合された2つのビームで、カーゲートと収集システムが収集したタイムゲート信号を最大化するように設定されています。

    • 4。結合された2つのビームで、カーゲートと収集システムが収集したタイムゲート信号を最大化するように設定されています。

    1. ポンプと信号ビームは、まず非線形媒質内でエキサイティングなラマン散乱からあらゆる残留励起光を防ぐために、404 nmでの6のODを持つダイクロイックフィルターを通過します。
    2. ポンプと信号ビームは両方非線形材料を含む1cmの光路長の石英キュベットに色消し（F = 35 mm）と集中しています。適切な高い非線形指数（CS 2よりも高い）、および適切に短い時間応答（<2 PS）を有する任意の非線形材料は、ここで利用することができます。これらの実験のために、我々は非線形屈折率n 2 = 3.1 × 10 -18 m 2の / Wを持っている二硫化炭素、CS 2を 、使用してください光は、最初と同じ焦点距離で2番目のダブレットでrecollimatedている。
    3. ビームは、回転マウント上にして、組み合わせは808 nmで10のODを持っていることを吸収し、干渉フィルターのセットを介して通過し、グラントムソンアナライザされています。
    4. 最後に、信号光は、光ファイバはx、y、zの翻訳を可能にする段階でマウントされている50μmマルチモード光ファイバ、に色消し（F = 35 mm）と焦点を当てています繊維は、接続されたCCDカメラ（それぞれSP2300iとPixis 100B、、プリンストンインスツルメンツ製の両方、トレントン、ニュージャージー州）と商業イメージング分光器に接続されている。
    5. 収集された信号を最大にする収集システムを揃えるには、アナライザは0に設定され°、トルエンのテストサンプルは、サンプルの平面に配置されます。繊維のマウントのx、y、zのコントロールを調整することにより、収集されたラマン信号が最適化されています。
    6. ポンプと信号ビームの適切な空間的および時間的重複を確保するため、ミラーは、顕微鏡の試料面に配置されます。 404 nmのフィルターがシステムから削除されます。アナライザで90 °回転再帰反射404 nmのビームは、それがカメラを飽和させないように調整強度を分光器に送信されます。オフポンプビームと、アナライザは送信される404 nmの信号を最小限に抑えるために回転する。ポンプビームがオンに戻すと404 nmの光の透過が増加し始めるまで、遅延ステージは徐々に調整されています。その後、繰り返し遅延ステージ、ピエゾミラー、および繊維のx、y、zのコントロールを調整することで、一つは信号を最大化します。
    7. レトロ反射404 nmの光とラマン散乱光は、システムを介してわずかに異なるパスを取る可能性があるため、最終的な調整を試料ステージに強いラマン散乱体を（トルエンなど）を配置することによって作られ、わずかに調整変更することにより、アライメントラマン信号を最適化するために繊維の段階で、piezeo -電動ミラー、、x、y、z各コン​​トロールを遅らせる。

    5。単一のタイムゲーティッドラマンスペクトルの収集は、複数のスペクトルの買収は、システムのアーチファクトを補正する必要があります。

    1. 0 °に設定アナライザ、励起ビームのオンとオフのポンプビームで、"ungated"スペクトル時間ゲーティングシステムの恩恵なしに取得されるスペクトルを表す、取得されます。
    2. アナライザは、90 °、励起光とポンプ光がオフのままに設定すると、バックグラウンドのスペクトルは、システム内の偏光板と他の要素を通じて漏れ迷光の量を表す、取得されます。
    3. 90℃で、残りのアナライザと°と上のすべての梁、"ゲート"スペクトルはポンプ光の存在によって交差した偏光子を通過できるラマン散乱光を表す、取られる。
    4. 最後に、まだ90 °、励起ビームのオフとポンプビーム上でアナライザを使用して、第二のバックグラウンドスペクトルが取られ、分光器に入る808 nmの光の残留量の"ゲート"スペクトルへの寄与を表す。
    5. さらに、スペクトルはカメラや電子機器のベースライン"暗い"信号レベルを特徴づける、すべてのレーザーをオフ取られます。
    6. スペクトルは、しばしば長い積分時間を必要とするため、それは宇宙線の適切な補正を可能にするいくつかの部分（フレーム）に、この積分時間を破ることが不可欠です - いくつかの分のスパンでデータを取得する共通の問題。

    6。一度取得されると、いくつかの処理ステップは、データの品質と外観を改善するために役立ちます。

    1. 最初に、すべてのスペクトルが濃い"濃い"スペクトルをオフに引くことにより補正される。
    2. 宇宙線を補正するために、1回の収集を構成するいくつかのフレームは、ピクセル単位で相互に比較されます。すべてのフレームでそのピクセルの中央値から2中央値偏差の外にある任意のフレームの任意のピクセルに対して、そのピクセルの値はすべてのフレーム間の中央値で置き換えられます。
    3. 宇宙線訂正のフレームは、その結果、平均化やSavitzky - Golayフィルタ1によって平滑化されています。
    4. "真の"ゲーティッドスペクトラムを抽出するには、我々は、測定ゲートスペクトルから"励起のみ"と"ポンプのみ"のスペクトルを減算する。
    5. 最後に、ゲートとungatedスペクトルは、リーバーとMahadevan -ジャンセン2の方法を用いて決定した第 5次多項式を、減算することによって補正さの背景です。

    7。代表的な結果：

    図1
    図1。カーゲーティングシステムの模式図。 SHGのパスは青で表示されている間、ポンプ光の経路は、赤色で表示されます。蛍光が時間的に除外されたパスが黄色で表示されている間ラマンと蛍光が重なっているパスは、緑で表示されます。次のように略語：BPF、バンドパスフィルタ、CCD、電荷結合素子、DCM、ダイクロイックミラー、FI、ファラデーアイソレータ、λ/ 2、半波長板、LPF、ロングパスフィルタ、NLM、非線形媒質、P、偏光板、SHG、第二高調波発生結晶。

    図2
    図2トップ：。浸油に溶解したクマリンの生のスペクトル。赤い曲線は開いたままゲート（最大伝送のためのアナライザのセット）で撮影したスペクトルを示しています。黒い曲線は、最小伝送とポンプビーム応用（ティッドスペクトラム）のために整列アナライザーで撮影したスペクトルを示す。青い曲線は、最小伝送と無ポンプビーム応用（ゲートが閉じて開催された）のために整列アナライザーで撮影したspectumを示しています。緑の曲線は、適用される唯一のポンプビームで撮影したスペクトルを示す。破線マゼンタの線は、下のパネルに示すようにスペクトル領域を示している。全てのスペクトルは11点、3次のSavitzky - Golayフィルタで平滑化されています。底部：蛍光バックグラウンドを差し引いた後の液浸油に溶解したクマリンのスペクトル。赤い曲線は、ゲートを持つスペクトルが開かれており、青色の曲線は、ゲーティッドスペクトラムです。ゲーティッドスペクトラムは、明らかにオイルの複雑な高波数のピーク特性を示しています。

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    Discussion: 共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

    生物医学ラマン分光法の分野は、生物学的診断でいくつかの困難な課題を解決するため、その実証可能性の結果として、過去数年間での関心の高まりを見ている。例えば、ラマンスペクトルは、癌の検出3、4、5、6の診断的価値を有することが示されている。ラマン分光法は、細菌の定量7、8、細菌の薬剤応答9にも使用されています。また、骨の健康10からbiofluid解析11、12に至るまで、他の生物医学アプリケーションの広い範囲で応用例が見つかりました。

    その非常に弱い断面：そのような偉大な可能性にもかかわらず、しかし、ラマン分光法は、ほとんどの生物系の過来て大きな障壁があります。したがって、ラマン信号は簡単であってもかなり控えめな蛍光バックグラウンドを圧倒することができます。多くの技術は、蛍光線形2、13、14を除去するために存在する。しかし、真に強い蛍光バックグラウンドを持つ主な問題に対処するこれらのテクニックのいずれも、蛍光バックグラウンドの存在によってスペクトルに寄与するショット雑音は、ラマン信号を圧倒していないし、離れて減算することはできません。このようなコヒーレント反ストークスラマン分光（CARS）と誘導ラマン散乱（または逆ラマン散乱）などのいくつかの手法が、、ラマン信号15、16、17の強度を増幅しようとするために開発されている。しかし、これらの技術のすべては、透明なサンプルに主に適用され、独自の背景や化学物質過敏症18の問題を抱えています。

    蛍光信号から検出器を遮蔽すること、真に自発ラマン散乱の蛍光バックグラウンドに関連付けられているショットのノイズを除去する唯一の方法です。 10年以上前、マトウシェクら。一時的にラマン及び蛍光信号19,20を分離する超高速カーシャッターを用いた蛍光拒絶を示した。しかし、現在までに、このシステムは過度に高いパルスエネルギーの必要性に起因する生物学分野で広く利用さを発見していない。この通信で紹介したシステムは、対照的に、以前のいくつかの報告に比べ1000倍弱いパルスエネルギーを利用し、生物学的システムと互換性があります。

    図1に示すように、我々のシステムは、電力を節約し、できるだけ非線形媒質内でポンプと信号ビームの間に限り重複を提供するために一直線カーゲートの形状を利用しています。さらに、我々は我々のカーシャッターを操作する使用可能な最大電力を持っていることを保証するためにできる限りの光損失を低減するように注意してください。このシステムを使用して我々はあらゆる光損傷21の観察なしに、すなわち高度に蛍光生体試料のラマンスペクトル、ジャスミンの植物の茎を取得しています。本報告書では、顕微鏡の液浸油に溶解した植物ベースの蛍光体（クマリン、τF≈5ナノ秒）のモデルシステム上でいくつかの代表的なデータを示しています。これを図2に示します。トップパネルには、我々は可視化の目的のために、その最大値の0.04％に縮小、赤で強い"ungated"スペクトル（0 °〜アナライザのセット）を参照してください。目に見える識別可能なラマンピークがないことに注意してください。以下、黒で、生のゲートスペクトル（上ポンプと励起レーザーの両方でのスペクトル、すなわち）です。その下に、青色で、交差した偏光子を通して漏れ残留蛍光を表す、上だけ励起レーザーとスペクトルである。最後に、緑色で、我々はシステム内に配置吸収と干渉フィルターの組み合わせにより、漏れ、ポンプレーザーによるバックグラウンドを参照してください。図2の下側のパネルでは、5次多項式の減算後のungatedとゲートスペクトラムの部分領域（上部パネルに破線マゼンタの線で示される領域）を参照してください。 ungatedスペクトルは、明確なラマン機能を持っていないながら、ゲーティッドスペクトラムは明らかに、脂質に関連付けられている高波数のピークを示しています。

    私たちのシステムは現在のところ大きなeffciencyで動作していませんが（実測どれだけの伝送は、5％程度になっている）、絶対的な信号強度は、通常、信号対雑音よりも重要です。従来のラマンスペクトルを測定することは困難または非現実的な圧倒的な蛍光バックグラウンドが原因となっている生体試料のいくつかの広範なクラスがあります。これらのサンプルについては、私たちのシステムは、図2に明らかに見られるように、明確な信号対ノイズの改善を提供することができます。

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    Disclosures: 共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

    利害の衝突は宣言されません。

    Acknowledgements: 共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

    この作品は、NSF賞DBI 0852891によって賄われていた。本研究の一部は、協力協定第PHY0120999の下、カリフォルニア、デービスの大学によって管理されるバイオフォトニクス科学技術、指定されたNSF科学技術センターセンターによって資金を供給された。

    Materials: 共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

    Name Company Catalog Number Comments
    Lenses Thorlabs Inc. Various All lenses coated to have maximum transmission losses of 1% each
    Tunable Ti:Sapph laser Coherent Inc. Chameleon 30 nJ, 200 fs, 80 MHz
    40X oil immersion objective Olympus Corporation UApo/340 NA = 1.35
    Inverted microscope Olympus Corporation IX-71 Modified to remove all lenses in side port
    Half wave plate Thorlabs Inc. AHWP05M-600
    Glan-Thompson polarizer Thorlabs Inc. GTH10M ˜10% transmission loss
    Spectrometer Princeton Instruments/Acton SP2300i
    CCD Princeton Instruments/Acton Pixis 100B
    Mathmatical software Mathworks MATLAB version 2008a
    Faraday isolator EOT BB8-5I
    Piezo-electric mirror Newport Corp. AG-M100
    BBO crystal CASIX custom 1 mm thickness
    Bandpass filter 1 Andover 008FC14 808 0.4 nm
    Dichroic mirror Semrock FF662-FDI01 band edge at 662 nm
    Long-pass filter Semrock BLP01-405R band edge at 417 nm
    Bandpass filter 2 Semrock FF02-447/60 417-447 nm
    CS2 Sigma-Aldrich 335266 99% purity
    Coumarin 30 Sigma-Aldrich 546127 99% purity
    Immersion oil Cargill Labs 16242 Type DF

    References: 共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

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