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 JoVE Bioengineering

El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

*1, *1, 1, 1,2

1Center for Biophotonics Science and Technology, University of California, Davis, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of California, Davis

* These authors contributed equally

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Cite this Article: El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

Smith, Z. J., Knorr, F., Pagba, C. V., Wachsmann-Hogiu, S. Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy. J. Vis. Exp. (51), e2592, doi:10.3791/2592 (2011).

Abstract: El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

Espectroscopia Raman es con frecuencia plagados de un fondo fluorescente intensa, particularmente para las muestras biológicas. Si la muestra se excita con un tren de pulsos ultrarrápidos, un sistema que puede separar temporalmente la superposición de señales de espectro en una escala de tiempo de picosegundos puede aislar rápidamente llega la luz Raman dispersada por que llegan tarde de luz fluorescente. Aquí hablamos de la construcción y operación de un complejo sistema no lineal óptico que utiliza todas las ópticas de conmutación en la forma de una puerta ópticas de bajo consumo Kerr para aislar las señales de Raman y de fluorescencia. A solo 808 nm láser con 2,4 W de potencia media y la tasa de 80 MHz se divide la repetición, con aproximadamente 200 mW de luz 808 nm se convierten en <5 mW de luz 404 nm enviado a la muestra para excitar a la dispersión Raman. El resto de la luz convertida nm 808 se envía a un medio no lineal, donde actúa como la bomba para el obturador totalmente ópticas. El obturador se abre y se cierra en 800 fs con la máxima eficiencia de aproximadamente el 5%. El uso de este sistema en el que son capaces de separar con éxito las señales de Raman y de fluorescencia a una velocidad de 80 MHz utilizando la repetición de impulsos y energías potencias medias que permanecen biológicamente seguros. Debido a que el sistema no tiene capacidad de reserva en términos de potencia óptica, que las consideraciones de varios detalles del diseño y la alineación que ayudan a maximizar el rendimiento del sistema. También se analiza el protocolo para la obtención de la superposición espacial y temporal de la señal y las vigas de la bomba en el medio Kerr, así como un protocolo detallado para la adquisición del espectro. Finalmente, se presenta un representante de los resultados de algunos espectros Raman obtenidos en presencia de fuerte fluorescencia utilizando nuestro tiempo-gating sistema.

Protocol: El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

1. Algunos se debe tener cuidado en la preparación y la colocación de una muestra de Raman dentro de este sistema.

  1. Debido a que normalmente el sistema hace uso de los objetivos de la apertura numérica muy alta con distancias de trabajo muy corto, las muestras se colocan en un portaobjetos. Las muestras biológicas se colocan normalmente en un cubreobjetos espesor N º 1 montado en una cámara de celular Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA).
  2. Las muestras líquidas, en particular los tóxicos para los humanos, se colocan en una pequeña botella de vidrio con un cubre consolidó con la apertura por medio de un epoxi de silicona. La botella se invierte para la medición.
  3. Debido a que nuestro sistema depende del momento preciso de la bomba y los pulsos de la señal, nos vemos obligados a no utilizar el ajuste del enfoque convencional de nuestro microscopio, que se traduce en el objetivo arriba y hacia abajo. Esta suma y resta de camino óptico de nuestro sistema. En su lugar, ponemos nuestras muestras en un escenario secundario montado en la parte superior de la platina del microscopio que tiene su propio control enfoque independiente.

2. A fin de tener tiempo-dependientes espectros Raman, el haz de excitación debe estar debidamente preparado.

  1. Comenzamos con la luz que emerge de un 2,4 W sintonizable pulsado Ti: Sapph láser (Chameleon, un sistema coherente, Santa Clara, CA). Cada pulso en el tren de pulso de 80 MHz con 30 nJ de energía, tiene una anchura de 140 fs temporal, y tiene un espectro centrado en 808 nm con un ancho de banda espectral de ~ 6 nm.
  2. Para evitar copias de los reflejos de volver a entrar en la cavidad del láser, la luz pasa a través de un aislador de Faraday. Una placa de media onda colocado antes de que el aislador de Faraday permite el ajuste continuo de la potencia total enviado en el sistema.
  3. Debido a 6 nm es demasiado amplio ancho de banda para resolver la mayoría de los modos Raman, el haz se envía a través de un filtro de banda muy estrecha (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) centrado en 808 nm.
  4. La luz es enfocada por un doblete acromático (f = 100 mm) en un 5 mm β-borato de bario (BBO) cristal (CASIX, Fuzhou, Fujian, China) reducir a la mitad la longitud de onda de 808 a 404 nm nm. El cristal BBO se coloca en un soporte con la punta y controles de inclinación, y también se monta en una etapa de traducción. Para maximizar la eficiencia de la conversión de longitud de onda, el cristal debe ser colocado con precisión simétrica con respecto al enfoque del doblete, y con su eje de cristal alineados con la polarización del haz incidente.
  5. Debido a la eficiencia de la conversión de longitud de onda es dependiente de la polarización, el control sobre la cantidad de luz emitida a la muestra se puede obtener mediante la colocación de un segundo de media onda después de la placa aislante de Faraday. Al girar este waveplate, la intensidad de la luz enviada a la muestra se puede ajustar de forma independiente de la intensidad enviado en el haz de la bomba (que trataremos más adelante).
  6. La longitud de onda de la luz es convertida recollimated por un doblete acromático segundo (f = 500 mm) elegirse de forma que el haz de salida es lo suficientemente grande como para llenar la apertura posterior del objetivo del microscopio, y se dirige en un microscopio invertido (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) a través de dos espejos de dirección.
  7. El objetivo del microscopio, siendo el elemento óptico ubicado en el componente más monolítica del sistema, define el eje óptico. Para alinear el haz de excitación a este eje, se coloca un espejo en el plano de la muestra del microscopio. Los dos espejos de dirección son entonces iterativamente ajustado observando la parte de atrás-se refleja en un rayo láser CCD cámara de la época (μEye, IDS, Obersulm, Alemania) conectado al puerto de imágenes del microscopio. Suponiendo que la imagen de la cámara se centra en el microscopio de campo de visión, el haz se encuentra en el eje cuando el punto focal se centra en el chip del microscopio y la traducción de los objetivos a lo largo del eje z no cambia el punto central del haz desenfocado.
  8. Cuando una muestra se coloca en el plano de la muestra y se irradia con luz láser Raman produce. Un filtro dicroico colocado debajo del objetivo del microscopio separa la longitud de onda de la luz-cambió Raman dispersos (y fluorescencia) del haz de excitación, la dirección de la luz Raman dispersos en el puerto lateral del microscopio. El microscopio fue modificado para eliminar las lentes dentro de su camino, de tal manera que la luz de la señal sale del microscopio colimado.
  9. Debido a que el haz de señal que sale del microscopio es más grande que la apertura clara de los polarizadores Glan-Thompson, un telescopio de 0.47x construida con dos dobletes acromáticos (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) se utiliza para reducir el tamaño del haz.
  10. La luz de señal es polarizada por un polarizador Glan-Thompson orientado a 0 ° con respecto a la vertical en el marco del laboratorio, y se dirige a un espejo dicroico donde se recombina con el haz de bombeo.

3. Para que la puerta óptica para operar a su máxima eficiencia, se debe tener cuidado en la preparación de la viga de la bomba (Kerr rayo), así.

El pulso de bombeo es magnificado por primera 0.35x con un telescopio construido con dos dobletes acromáticos (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) para que coincida con el tamaño final de la viga de la señal.
  • El haz de bombeo se envía en una línea de retardo compuesto por un prisma de ángulo recto colocado en una etapa de traducción lineal que se puede ajustar para asegurar la coincidencia temporal de la bomba y los pulsos de la señal (de ajuste que se discutirán más adelante).
  • Después de la línea de retardo, el haz se envía a través de una placa de media onda y el polarizador orientado a 45 ° con respecto a la vertical en el marco del laboratorio. Esto asegura que el estado de polarización del haz adecuado de la bomba cuando se alcanza el medio no lineal.
  • La luz es reflejada por dos espejos de dirección, con un piezo-eléctricos de control, que se utilizan para ajustar con precisión la posición del haz de bombeo de tal manera que se superpone espacialmente con el haz de señal. La superposición se obtiene mediante la observación de la bomba y las vigas de la señal en dos lugares, uno cerca y un lejos del espejo dicroico, donde las vigas se combinan. Al utilizar el espejo de dirección primero de los dos haces se superponen en el punto próximo, y el espejo piezo a la superposición de las vigas en el punto más alejado, el haz de bombeo se puede hacer exactamente alineados con el haz de señal.
  • Con los dos haces combinados, la puerta de Kerr y el sistema de recolección están preparados para maximizar el tiempo-dependientes recogida de la señal.

    • 4. Con los dos haces combinados, la puerta de Kerr y el sistema de recolección están preparados para maximizar el tiempo-dependientes recogida de la señal.

    1. Las vigas de la bomba y la señal se pasa primero por un filtro dicroico que tiene un diámetro exterior de 6 a 404 nm para evitar que la luz de excitación residual de la dispersión Raman emocionante en el medio no lineal.
    2. La bomba y las vigas de la señal son entonces los dos se centró por un doblete acromático (f = 35 mm) en una cubeta de 1 cm paso de luz de cuarzo que contiene el material no lineal. Cualquier material no lineal con un alto índice adecuado no lineal (superior a CS 2), y la respuesta temporal adecuada a corto (<2 ps), se pueden utilizar aquí. Para estos experimentos, se utiliza disulfuro de carbono, CS 2, que tiene un índice no lineal n 2 = 3,1 x 10 -18 m 2 / W. La luz se recollimated por un doblete en segundo lugar con una distancia focal idéntica a la primera.
    3. Las vigas se pasan a través y Glan-Thompson analizador en un montaje giratorio, y luego a través de un conjunto de filtros de absorción y la interferencia que combinados tienen un diámetro exterior de 10 a 808 nm.
    4. Finalmente, la señal de luz es enfocada por un doblete acromático (f = 35 mm) en un 50 micras de fibra óptica multimodo, donde se monta la fibra en una etapa que permite la traducción de x, y, z. La fibra se acopla a un espectrógrafo de imágenes comerciales con cámara CCD adjunta (SP2300i Pixis y 100B, respectivamente, ambos fabricados por Princeton Instruments, Trenton, NJ).
    5. Para alinear el sistema de recolección para maximizar la señal recogida, el analizador se ajusta a 0 ° y una muestra de tolueno se coloca en el plano de la muestra. Mediante el ajuste de la x, y, z de los controles y el monte de fibra, la señal recogida Raman se ha optimizado.
    6. Para garantizar la correcta superposición espacial y temporal de la bomba y las vigas de la señal, se coloca un espejo en el plano de la muestra del microscopio. El filtro de 404 nm es eliminado del sistema. Con el analizador de girar hasta 90 º el haz de 404 nm retrorreflejada se envía en el espectrógrafo con la intensidad ajustada de tal manera que no se satura la cámara. Con el haz de bomba, el analizador se gira para reducir al mínimo la señal de 404 nm de transmisión. Con el haz de bombeo se vuelve a encender, la etapa de retraso es poco a poco ajustado hasta que la transmisión de la luz 404 nm comienza a aumentar. Luego, por la etapa de ajuste iterativamente demora, el espejo piezo-eléctrico, y la x, y, z y los controles de la fibra, una maximiza la señal.
    7. Debido a que la retro-reflejado 404 nm y el haz de la luz dispersada Raman puede tomar caminos ligeramente diferentes a través del sistema, los ajustes finales se realizan mediante la colocación de una gran dispersor de Raman (como el tolueno) en el escenario de la muestra y el ajuste ligeramente la alineación al cambiar la fase de retardo, espejo piezeo-eléctrica, y x, y, z controles de la fibra para optimizar la señal Raman.

    5. La recolección de una sola vez-gated espectro Raman requiere la adquisición de varios espectros para corregir los artefactos del sistema.

    1. Con el analizador a 0 °, el haz de excitación en el haz y bomba, un "ungated" espectro se toma, lo que representa el espectro que se puede adquirir sin el beneficio del sistema de tiempo de activación periódica.
    2. Con el analizador de establece en 90 °, el haz de excitación y el haz de bombeo sigue apagado, un espectro de fondo se toma, lo que representa la cantidad de luz difusa se escapa a través de los polarizadores y otros elementos en el sistema.
    3. Con el analizador restante a 90 °y todas las vigas, la "puerta" del espectro se toma, en representación de la luz Raman dispersos permite a través de los polarizadores cruzados por la presencia de la viga de la bomba.
    4. Finalmente, con el analizador aún a 90 °, el haz de excitación fuera y el haz de bombeo en un espectro de fondo segunda está tomada, lo que representa la contribución a la "puerta" espectro de cantidades residuales de la luz 808 nm de entrar en el espectrógrafo.
    5. Además, un espectro se toma con todos los láseres de, la caracterización de la línea de fondo "oscuro" nivel de la señal de la cámara y la electrónica.
    6. Debido a que el espectro de frecuencia requieren largos tiempos de integración, es imprescindible romper este tiempo de integración en varias piezas (frames) para permitir la corrección adecuada de los rayos cósmicos - un problema común en la adquisición de datos a través de lapsos de varios minutos.

    6. Una vez adquirido, varios pasos de procesamiento son útiles para mejorar la calidad y el aspecto de los datos.

    1. En primer lugar, todos los espectros son de color corregido restando de la "oscuridad" del espectro.
    2. Para corregir los rayos cósmicos, los marcos de varios constituyen una adquisición se comparan entre sí sobre una base píxel por píxel. Para cualquier píxel de cualquier cuadro que se encuentra fuera de 2 desviaciones media del valor de la mediana de ese píxel en todos los fotogramas, el valor de ese píxel se sustituye por el valor de la mediana en todos los fotogramas.
    3. Los marcos de los rayos cósmicos corregido se promedian y suavizada por un filtro Savitzky-Golay 1.
    4. Para extraer el "verdadero" espectro cerrada, se resta la "excitación-only" y "bomba de sólo" espectro del espectro medido cerrada.
    5. Finalmente, los espectros de una verja y luego se ungated con corrección de fondo restando un 5 º orden polinomio, determinó utilizando el método de Lieber y Mahadevan-Jansen 2.

    7. Los resultados representativos:

    Figura 1
    Figura 1. Diagrama esquemático del sistema de gating Kerr. La trayectoria del haz de la bomba se muestra en rojo, mientras que la ruta de los grupos de autoayuda se muestra en azul. La ruta donde Raman y de fluorescencia se solapan se muestra en verde, mientras que la ruta donde ha sido el de fluorescencia temporal filtrado se muestra en amarillo. Abreviaturas de la siguiente manera: BPF, filtro pasa banda, CCD, dispositivo de carga acoplada, DCM, espejo dicroico, FI, Faraday aislador; λ / 2, placa de media onda, LPF, filtro de paso largo, mediano NLM, no lineal, p, polarizador ; cristal de SHG, la segunda generación de armónicos.

    Figura 2
    Figura 2 Arriba:. Espectros primas de cumarina disuelto en aceite de inmersión. Curva roja muestra el espectro tomado con la puerta abiertos (analizador de conjunto para la transmisión máxima). Curva en negro muestra el espectro tomado con el analizador de alineado de transmisión mínima y una bomba de rayo aplicada (el espectro cerrada). Curva azul muestra la spectum tomada con el analizador alineado para la transmisión mínimo y no se aplica la bomba de rayo (la puerta se mantiene cerrada). Curva verde muestra el espectro tomado con sólo el haz de bombeo aplicada. Líneas discontinuas indican magenta región espectral se muestra en el panel de abajo. Todos los espectros han sido suavizados con un punto de 11, 3 º fin de Savitzky-Golay filtro. Abajo: Los espectros de cumarina disuelto en aceite de inmersión después de fluorescencia de la sustracción de fondo. Curva roja es el espectro con la puerta abiertos, y la curva azul es el espectro de acceso controlado. El espectro cerrada muestra claramente el alto número de onda complicada pico característico de los aceites.

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    Discussion: El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

    El campo de la espectroscopia Raman biomédica ha visto un creciente interés en los últimos años como resultado de su potencial demostrado para la solución de varios problemas difíciles en el diagnóstico biológico. Por ejemplo, los espectros Raman se ha demostrado que tiene valor diagnóstico en la detección del cáncer de 3, 4, 5, 6. La espectroscopía Raman se ha utilizado también en la cuantificación de bacterias 7, 8 y 9 bacteriana respuesta a los fármacos. Se ha encontrado también aplicación en una amplia gama de otras aplicaciones biomédicas que van desde la salud ósea de 10 a biofluid análisis de 11, 12.

    A pesar del potencial tan grande, sin embargo, la espectroscopia Raman tiene una gran barrera a la sobre-vienen en la mayoría de los sistemas biológicos: su extrema debilidad sección transversal. Por lo tanto, las señales de Raman puede ser fácilmente abrumados por fluorescentes, incluso fondos muy modestos. Existen muchas técnicas para la eliminación de la fluorescencia LineShape 2, 13, 14. Sin embargo, ninguna de estas técnicas realmente resolver el problema principal con una sólida formación fluorescentes; la toma de ruido contribuido a las por la presencia de los abruma fondo fluorescente que la señal Raman y no se pueden restar de distancia. Varias técnicas, como por ejemplo coherente de lucha contra la espectroscopia Raman Stokes (CARS) y la dispersión Raman estimulado (o dispersión Raman inversa), se han desarrollado para tratar de ampliar la fuerza de la señal Raman 15, 16, 17. Sin embargo, todas estas técnicas son principalmente aplicables a muestras transparentes y tienen sus propios fondos y los problemas con la sensibilidad química de 18 años.

    Blindaje del detector de la señal de fluorescencia es la única manera de rechazar el verdadero ruido de disparo asociado con la fluorescencia de fondo en la dispersión Raman espontánea. Más de una década, Matousek et al. demostró el rechazo de fluorescencia utilizando un obturador ultra rápido Kerr para aislar temporalmente las señales de Raman y de fluorescencia de 19, 20. Sin embargo, hasta la fecha, este sistema no ha encontrado un amplio uso en el campo biológico debido a la necesidad de energías de pulso excesivamente altos. El sistema que se presenta en esta comunicación, por el contrario, utiliza 1000 veces más débil pulso de las energías de algunos informes anteriores y es compatible con los sistemas biológicos.

    Nuestro sistema, que se muestra en la Figura 1 utiliza una geometría colineal Kerr puerta para ahorrar energía y proporcionar, en mucha superposición entre la bomba y las vigas de la señal en el medio no lineal como sea posible. Además, nosotros nos encargamos de reducir las pérdidas ópticas tanto como sea posible para asegurar que tenemos la potencia máxima disponible para operar nuestro obturador Kerr. El uso de este sistema que hemos obtenido espectros Raman de alta fluorescencia de muestras biológicas, a saber, un tallo de la planta de jazmín, sin la observación de cualquier daño solar 21. En este informe se muestran algunos datos representativos en un sistema modelo de un fluoróforo a base de plantas (cumarina, τF ≈ 5 ns) disuelto en el aceite de microscopio de inmersión. Esto se muestra en la Figura 2. En el panel superior, vemos el fuerte "ungated" espectro (analizador de conjunto a 0 °) en rojo, escala al 0,04% de su valor máximo para fines de visualización. Tenga en cuenta que no hay picos discernible visible Raman. A continuación, en negro, es el espectro de primas cerrada (es decir, el espectro de la bomba y la excitación láser en). Más abajo, en azul, es el espectro sólo con el láser de excitación en el, lo que representa la fluorescencia residual se escapa a través de los polarizadores cruzados. Finalmente, en verde, vemos el fondo debido a que el láser de la bomba con fugas a través de la combinación de filtros de absorción e interferencia colocado en el sistema. En el panel inferior de la figura 2 vemos una subregión del espectro ungated y cerrado (región indicada por líneas de color magenta de puntos en el panel superior) después de la sustracción de un polinomio de 5 º orden. El espectro cerrada muestra claramente el pico de número de onda de alta asociados con lípidos, mientras que el espectro ungated no tiene características Raman claro.

    Aunque nuestro sistema no funciona con effciency grandes en la actualidad (transmisión maxiumum medida ha sido de alrededor del 5%), intensidad de la señal absoluta es generalmente menos importante que la relación señal-ruido. Hay varias clases amplias de muestras biológicas para que la medición de los espectros Raman convencional es difícil o poco práctico debido a la abrumadora antecedentes de fluorescencia. Para estas muestras, el sistema puede proporcionar una clara señal-ruido mejora, como se ve claramente en la figura 2.

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    Disclosures: El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

    No hay conflictos de interés declarado.

    Acknowledgements: El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

    Este trabajo fue financiado por el premio de la NSF DBI 0852891. Parte de este trabajo también fue financiado por el Centro de Ciencia y Tecnología Biofotónica, uno designado Ciencia NSF y el Centro de Tecnología gestionado por la Universidad de California, Davis, en virtud del Acuerdo de Cooperación No. PHY0120999.

    Materials: El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

    Name Company Catalog Number Comments
    Lenses Thorlabs Inc. Various All lenses coated to have maximum transmission losses of 1% each
    Tunable Ti:Sapph laser Coherent Inc. Chameleon 30 nJ, 200 fs, 80 MHz
    40X oil immersion objective Olympus Corporation UApo/340 NA = 1.35
    Inverted microscope Olympus Corporation IX-71 Modified to remove all lenses in side port
    Half wave plate Thorlabs Inc. AHWP05M-600
    Glan-Thompson polarizer Thorlabs Inc. GTH10M ˜10% transmission loss
    Spectrometer Princeton Instruments/Acton SP2300i
    CCD Princeton Instruments/Acton Pixis 100B
    Mathmatical software Mathworks MATLAB version 2008a
    Faraday isolator EOT BB8-5I
    Piezo-electric mirror Newport Corp. AG-M100
    BBO crystal CASIX custom 1 mm thickness
    Bandpass filter 1 Andover 008FC14 808 ± 0.4 nm
    Dichroic mirror Semrock FF662-FDI01 band edge at 662 nm
    Long-pass filter Semrock BLP01-405R band edge at 417 nm
    Bandpass filter 2 Semrock FF02-447/60 417-447 nm
    CS2 Sigma-Aldrich 335266 99% purity
    Coumarin 30 Sigma-Aldrich 546127 99% purity
    Immersion oil Cargill Labs 16242 Type DF

    References: El rechazo de la fluorescencia de fondo en la resonancia y microespectroscopía Raman espontánea

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