Finger-stick Blodprovstagning Metodik för bestämning av ansträngningsutlöst-lymfocyter Apoptos

1. Finger-Stick Blodprovstagning

1. Insamling av helblod är normalt tas vid vila en baslinje mätning (vanligtvis efter 10-15 minuter sittande vila), under eller omedelbart efter en övning skjutningen, och under hela tiden efter löptid (i allmänhet från 1-3 timmar efter upphörande av motion).
2. Använda Universal försiktighetsåtgärder, först sterilisera fingertoppen med 70% isopropylalkohol.
3. Därefter punktera webbplats med hjälp av ett automatiserat lansett eller liknande anordning. Även om vi använder en 30-gauge lancett att tillhandahålla föremål komfort, kan en större nål användas.
4. Torka bort den första bloddroppen och sedan samla in blod i kapillärrör eller microvettes behandlas med litium heparin för att förhindra koagulering.

2. Cell fenotypning och Apoptos färgning

1. Tillsätt 10 mikroliter hepariniserat helblod till titred antikropp panel i 250 mikroliter bindande buffert (se tabell 1 schematisk). Vi har använt en faktor 1:20 utspädning med framgång, men varje laboratorium bör titer deras reagens för att bestämma den bästa fungerande lösning.
   Tabell 1. Antikroppar panel för fastställande av ansträngningsutlöst apoptos i leukocyter delmängder. Tidig apoptos definierades av uttryck av Annexin V, medan sena apoptos definierades genom att dubbelklicka positiv märkning med Annexin V och 7-AAD. Nekrotiska celler Annexin V-och 7-AAD + celler.
   

   Rör 1	Tube 2	Tube 3	Tube 4
   Celler rör enbart	Annexin V - FITC	Annexin V - FITC	Annexin V - FITC
   	Anti Human CD4 - PE	Anti Human CD8 - PE	Anti Human CD19 - PE
   	7-AAD	7-AAD	7-AAD
   	Anti Human CD45RA - APC	Anti Human CD45RA - APC

   
   7-AAD = 7-Amino-actinomycin D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Helper T-lymfocyter, CD8 = suppressor / cytotoxiska T-lymfocyter, CD19 = B-lymfocyter, CD45RA = naiva cell undergrupper, FITC = fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin.
2. Inkubera vid rumstemperatur i mörker i 30 minuter.
3. Centrifugera vid 1075 xgi 50-10 minuter.
4. Dekantera, lägg till 300 mikroliter Red Blood Buffer cellslys, och grundligt skaka.
5. Inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
6. Tillsätt 300 mikroliter PBS för att stoppa RBC lys reaktion.
7. Centrifugera vid 1075 xgi 50-10 minuter.
8. Dekantera, rack, och tillsätt 50 mikroliter bindande buffert.
9. Analysera med flödescytometri.

Det rekommenderas att åtminstone vara följande kontroller använts: ett celler endast rör för att fungera som en negativ kontroll att upptäcka bakgrunden autofluorescens och rör med varje enskild fluorokrom att ställa ersättning under första uppsättning av flödescytometern. Dessutom har vi använt pärlor ersättning standard framgångsrikt att ställa upp våra experiment.

Ett minimalt invasiv provtagning och den efterföljande analysen visas för analys av både tidiga och sena faser av ansträngningsutlöst lymfocyter apoptos. Det är också möjligt att tydligt utesluta de celler, som är nekrotisk och inte apoptotiska. Detta förfarande övervinner nackdelarna och obehag i samband med invasiva venpunktionen från armvecket regionen Vid flera tillfällen undersöktes före, under och omedelbart efter träning, eller sörjer en kateter under hela övningen matchen. När det gäller utredare, sådana förfaranden brukar kräva specialutbildning i flebotomi, som inte alla individer har. Dessutom ämne rekrytera och behålla väntas bli bättre med hjälp av detta förfarande, vilket ökar potentialen statistisk styrka för att finna en signifikant effekt om man är närvarande.

Tidigare undersökningar anställa provtagning venpunktion blod har rapporterat vila och efter motion värden för totala lymfocyter. Använda Annexin V, Simpson et al. Rapporterade cirka 1,2% apoptotiska lymfocyter i vila, och ~ 1,3% efter löpbandet kör ^1. Likaså rapporterade Steensberg et al. ~ 1,8% total apoptotiska lymfocyter i vila, och cirka 2,1% efter 2,5 timmar att köra ^2. Vårt resultat för apoptotiska lymfocyter med hjälp av finger-stick som beskrivs här är lika med 0,7 ± 0,2% observerades vid vila, och 1,1 ± 0,4% efter övning i att fem personer som avslutat en graderad konditionstest (opublicerade resultat).

En av begränsningarna i tidigare metod som används för att bestämma ansträngningsutlöst immunceller döden var den tid som krävs för att bearbeta ett blodprov. I tidigare undersökningar fick prover omedelbart postexercise genom venpunktion utsattes för en lång isolering och beredningsprocessen (så länge som 2 timmar) innan slutligen bedöms för celldöd ^3-5. Det är rimligt att spekulera i att sådan behandling förseningar på konstgjord väg kan höja rapporterade efter träning värden lymfocyter apoptos. I vissa fall har Annexin V positiva lymfocyter har rapporterats vara så hög som ~ 25% ^6. Ytterligare tolkning av denna metodologiska confounder väcker frågan om huruvida de rapporterade värdena för lymfocyter apoptos berodde på att utöva eller blod förseningar bearbetning. Vi föreslog att tidigare metoder inte korrekt återspeglar den effekt som motion har på inducera celldöd i immunceller ^7.

Använda metoden visat här minskar den mängd blod som krävs för varje samling tidpunkt. Dessutom minskar vår strategi prov-handläggningstiden, vilket kan minska förekomsten av falska positiva för lymfocyter apoptos. I detta protokoll, helblod läggs till antikroppen panel inom 30-sekunder efter blodinsamling, vilket minskar risken att lymfocyter framsteg genom apoptotiska processen och elimineras innan antikroppar färgning. Detta förfarande övervinner mätningen begränsningar tidigare diskuterats, och möjliggör kvantifiering av apoptotiska lymfocyter induceras av träning som en fysiologisk stimulans. Framtida studier med avseende på denna metod bör utvärdera potentiella skillnaderna med större spårvidd lansetter.

Dessutom kan den metod som beskrivs i detta dokument för bestämning av både tidiga och sena skede ansträngningsutlöst apoptos i lymfocyter delmängder (se tabell 1). Celler färgade med Annexin V endast i den tidiga fasen av apoptos, medan dubbel-färgning med Annexin V och 7-AAD visar progression genom celldöd process för att de senare stadierna. Celler markerade med 7-AAD ensam indikerar genomgår celldöd genom nekros. Fenotypning av lymfocyter sker genom kluster av differentiering markörer (CD4 = helper T-lymfocyter, CD8 = cytotoxiska / suppressor T-lymfocyter, CD45RA = naiv subfractions, CD19 = B-lymfocyter).