Finger-stick Metodologia di campionamento del sangue per la determinazione di esercizio apoptosi indotta da linfociti

1. Finger-Stick prelievo di sangue

1. Raccolta di sangue intero è di solito presi a riposo per una misura di base (di solito dopo 10-15 resto seduto min), durante o immediatamente dopo un attacco di esercizio, e per tutto il periodo post-esercizio (in genere da 1-3 ore dopo la cessazione del esercizio fisico).
2. Utilizzando le precauzioni universali, in primo luogo sterilizzare la punta del dito con il 70% di alcool isopropilico.
3. Successivamente, la puntura il sito utilizzando un bisturi automatici o dispositivi simili. Anche se si usa un 30-gauge bisturi per offrire il comfort soggetto, un ago di diametro più ampio potrebbero essere utilizzati.
4. Eliminare la prima goccia di sangue, e poi raccogliere in provette di sangue capillare o microvettes trattati con litio eparina per prevenire la coagulazione.

2. Fenotipizzazione delle cellule e colorazione apoptosi

1. Aggiungere 10 microlitri di sangue intero eparinizzato al pannello di anticorpi titolati in 250 microlitri di buffer vincolanti (vedi tabella 1 schema). Abbiamo usato un fattore di diluizione 1:20 con successo, ma ogni laboratorio dovrebbe titolo i loro reagenti per determinare la migliore soluzione di lavoro.
   Tabella 1. Pannello di anticorpi per la determinazione di esercizio apoptosi indotta in sottoinsiemi dei leucociti. Apoptosi precoce è stato definito mediante l'espressione di annessina V, mentre l'apoptosi in ritardo è stato definito con un doppio etichettatura positiva con annessina V e 7-AAD. Le cellule necrotiche erano annessina V e 7-AAD + solo le celle.
   

   Provetta 1	Provetta 2	Tubo 3	Tubo 4
   Solo le cellule del tubo	Annessina V - FITC	Annessina V - FITC	Annessina V - FITC
   	Anti CD4 umano - PE	Anti umane CD8 - PE	Anti umani CD19 - PE
   	7-AAD	7-AAD	7-AAD
   	Anti umani CD45RA - APC	Anti umani CD45RA - APC

   
   7-AAD = 7-amino-actinomicina D, APC = Allophycocyanin, CD4 = linfociti T helper, CD8 = soppressore / linfociti T citotossici, i linfociti B CD19 =, CD45RA = sottopopolazioni cellulari ingenuo, FITC = isotiocianato di fluorescina, PE = ficoeritrina.
2. Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
3. Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti.
4. Decantare, aggiungere 300 ul Red Cell Lysis Buffer sangue, e completamente vortice.
5. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
6. Aggiungere 300 ml di PBS per fermare la reazione di lisi.
7. Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti.
8. Decantare, rack, e aggiungere 50 microlitri di buffer vincolanti.
9. Analizzare mediante citometria di flusso.

Si raccomanda, come minimo, i seguenti controlli da utilizzare: un solo tubo di cellule per servire come controllo negativo nel rilevare autofluorescenza sfondo, e le provette contenenti ciascuno fluorocromo per impostare compensazione durante l'impostazione iniziale della citometria a flusso. Inoltre, abbiamo utilizzato perline standard di compensazione con successo per creare i nostri esperimenti.

Un mini-invasiva procedura di raccolta dei campioni e successiva analisi è dimostrato per l'analisi delle fasi sia precoce e tardiva di esercizio apoptosi indotta da linfociti. E 'anche possibile escludere con chiarezza quelle cellule, che sono necrotico, e non apoptotica. Questa procedura risolve gli inconvenienti ed il disagio associato a venipuntura invasiva della regione antecubitale in momenti diversi, prima, durante e immediatamente dopo l'esercizio o attribuisce un catetere per tutta la durata della sessione di attività fisica. Dal punto di vista degli investigatori, tali procedure di solito richiedono una formazione specializzata nel salasso, che non tutti gli individui hanno. Inoltre, di reclutamento dei soggetti e la conservazione dovrebbe essere migliorata con questa procedura, aumentando così il potere potenziale statistico di trovare un effetto significativo se presente.

Inchieste precedenti impiegando prelievo di sangue venoso hanno riportato valori a riposo e post-esercizio per i linfociti generale. Utilizzando annessina V, Simpson et al. Riportate approssimativamente 1,2% apoptotico dei linfociti a riposo, e ~ tapis roulant 1,3% dopo l'esecuzione ^1. Allo stesso modo, Steensberg et al. Riportato ~ 1,8% linfociti apoptotici a riposo totale, e circa il 2,1% dopo 2,5 ore di funzionamento ^2. I nostri risultati per apoptosi dei linfociti con il dito-stick procedura descritta qui sono simili, con 0,7 ± 0,2% osservato a riposo, e 1,1 ± 0,4% post-esercizio in cinque soggetti che hanno completato un test di esercizio graduato (risultati non pubblicati).

Uno dei limiti della metodologia utilizzata per determinare precedente esercizio morte cellulare indotta immunitario era la quantità di tempo necessario per elaborare un campione di sangue. Nelle precedenti inchieste, campioni ottenuti immediatamente postexercise mediante venipuntura stati sottoposti a un lungo isolamento e il processo di preparazione (fino a 2 ore) prima di eventualmente in corso di valutazione per la morte delle cellule ^3-5. È ragionevole ipotizzare che i ritardi tale trattamento può elevare artificialmente riportata post-esercizio i valori apoptosi dei linfociti. In alcuni casi, i linfociti annessina V positivi sono stati segnalati per essere alto come ~ 25% ^6. Un'interpretazione più ampia della confondente metodologico pone la questione se i valori riportati per l'apoptosi dei linfociti erano dovuti ad esercitare o ritardi di lavorazione del sangue. Abbiamo suggerito che la metodologia precedente non riflettono con precisione l'effetto che l'attività fisica ha sulla inducendo la morte cellulare nelle cellule immunitarie ^7.

Utilizzando la metodologia dimostrato qui diminuisce la quantità di sangue necessaria per ogni punto di tempo di raccolta. Inoltre, il nostro approccio campione diminuisce il tempo di elaborazione, che può ridurre l'incidenza di falsi positivi per l'apoptosi dei linfociti. In questo protocollo, il sangue intero viene aggiunto al pannello di anticorpi entro 30 secondi dopo la raccolta del sangue, riducendo così il potenziale che i linfociti attraverso il processo apoptotico e vengono eliminati prima della colorazione degli anticorpi. Questa procedura supera i limiti di misura discusso in precedenza, e permette per la quantificazione dei linfociti apoptotici indotta da esercizio fisico come stimolo fisiologico. Studio futuro per quanto riguarda questa metodologia dovrebbe valutare le differenze di potenziale con lancette diametro più ampio.

Inoltre, la metodologia descritta in questo documento consente la determinazione della fase precoce e tardiva, sia indotta da esercizio fisico apoptosi dei linfociti in sottoinsiemi (vedi tabella 1). Cellule colorate con annessina V sono solo nella fase iniziale di apoptosi, mentre la doppia colorazione con annessina V e 7-AAD indicano la progressione attraverso il processo di morte cellulare per le ultime fasi. Cellule contrassegnati con 7-AAD soli sono indicativi di subire la morte cellulare attraverso la necrosi. Fenotipizzazione dei linfociti si realizza attraverso cluster di marcatori di differenziazione (CD4 = linfociti T helper, CD8 = citotossici / soppressori linfociti T, CD45RA = subfrazioni ingenuo, CD19 = linfociti B).