Ponta de dedo Metodologia de amostragem de sangue para a determinação da apoptose induzida pelo exercício de Linfócitos

1. Dedo-Stick coleta de sangue

1. Coleta de sangue total é normalmente tomadas em repouso por uma base de referência (normalmente após 10-15 min de repouso sentado), durante ou imediatamente após uma sessão de exercícios, e durante todo o período pós-exercício (geralmente de 1-3 horas após a interrupção do exercício).
2. Utilizando precauções universais, primeiro esterilizar a ponta do dedo com 70% de álcool isopropílico.
3. Punção, próximo do local usando uma lanceta automatizado ou dispositivo similar. Apesar de usarmos uma lanceta de calibre 30 para fornecer para o conforto assunto, uma agulha de maior calibre podem ser utilizados.
4. Limpe a primeira gota de sangue, e depois coletar sangue em tubos capilares ou microvettes tratados com heparina de lítio para prevenir a coagulação.

2. Fenotipagem de células e de coloração Apoptose

1. Adicionar 10 mL de sangue heparinizado inteiro para painel de anticorpos titred em 250 mL de buffer de ligação (ver esquema tabela 1). Nós temos usado um fator de diluição de 1:20 com sucesso, mas cada laboratório deve titre seus reagentes para determinar a melhor solução de trabalho.
   Tabela painel de anticorpos 1. Para a determinação de exercício na apoptose induzida por subconjuntos de leucócitos. Apoptose precoce foi definido pela expressão de anexina V, enquanto apoptose tardia foi definida pela rotulagem positiva duplo com anexina V e 7-AAD. Células necróticas foram anexina V e 7-AAD + apenas células.
   

   Tubo 1	Tubo 2	Tubo 3	Tubo de 4
   Células do tubo só	Anexina V - FITC	Anexina V - FITC	Anexina V - FITC
   	Anti CD4 humanos - PE	Anti Humanos CD8 - PE	Anti Humanos CD19 - PE
   	7-AAD	7-AAD	7-AAD
   	Anti Humanos CD45RA - APC	Anti Humanos CD45RA - APC

   
   7-AAD = 7-Amino-actinomicina D, APC = Allophycocyanin, CD4 = linfócitos T helper, linfócitos CD8 = supressoras / citotóxicas T, CD19 = B linfócitos, CD45RA = subpopulações de células ingênuo, FITC = isotiocianato de fluoresceína, PE = Ficoeritrina.
2. Incubar a temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.
3. Centrifugar a 1075 xg por 5-10 minutos.
4. Decantar, adicionar 300 mL de sangue Red Tampão de Lise Celular, e completamente vortex.
5. Incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
6. Adicionar 300 mL PBS para parar RBC reação de lise.
7. Centrifugar a 1075 xg por 5-10 minutos.
8. Decantar, rack, e adicionar 50 mL de buffer de ligação.
9. Analisar por citometria de fluxo.

Recomenda-se que, no mínimo, os seguintes controles ser utilizados: um tubo de células apenas para servir como controle negativo na detecção de autofluorescência de fundo, e os tubos contendo cada um fluorocromo para definir a compensação durante a configuração inicial do citômetro de fluxo. Além disso, temos utilizado com sucesso contas de compensação padrão para configurar nossos experimentos.

Um procedimento de coleta de amostra e minimamente invasiva posterior análise é demonstrado para a análise das fases precoce e tardia da apoptose induzida pelo exercício de linfócitos. Também é possível excluir aqueles claramente células, que são necróticas, e não apoptóticas. Este procedimento supera os inconvenientes e desconforto associado a punção venosa invasoras da região antecubital em momentos múltiplos antes, durante e imediatamente após o exercício, ou conseguir um cateter para a duração da sessão de exercícios. Em termos de pesquisadores, tais procedimentos normalmente requerem formação especializada em flebotomia, que nem todos os indivíduos têm. Além disso, o recrutamento e retenção assunto deverá ser reforçada através deste procedimento, aumentando assim o poder potencial estatístico de encontrar um efeito significativo se estiver presente.

Investigações anteriores empregando amostras de sangue punção venosa relataram valores de repouso e pós-exercício para linfócitos em geral. Utilizando anexina V, Simpson et al. Relatados cerca de 1,2% linfócitos apoptóticos em repouso, e ~ esteira 1,3% abaixo de funcionamento ^1. Da mesma forma, Steensberg et al. Relataram ~ 1,8% do total de linfócitos apoptóticos em repouso, e aproximadamente 2,1% após 2,5 horas de funcionamento de ^2. Nossos resultados para linfócitos apoptóticos usando o procedimento de ponta de dedo aqui descritas são semelhantes, com 0,7 ± 0,2% observados em repouso, e 1,1 ± 0,4% pós-exercício em cinco indivíduos que completaram um teste de exercício graduado (resultados não publicados).

Uma das limitações da metodologia anterior usado para determinar o exercício a morte celular induzida imune foi a quantidade de tempo necessário para processar uma amostra de sangue. Em investigações anteriores, as amostras obtidas por punção venosa imediatamente pós-exercício foram submetidos a um isolamento prolongado e processo de preparação (contanto que 2 h) antes de eventualmente ser avaliados para a morte celular ^3-5. É razoável especular que os atrasos de processamento de tais pode elevar artificialmente relatados pós-exercício valores apoptose de linfócitos. Em alguns casos, os linfócitos anexina V positivos foram relatados para ser tão alta quanto 25% ~ ^6. Outra interpretação da confundidor metodológicas levanta a questão de saber se os valores reportados para a apoptose de linfócitos foram devido ao exercício ou atrasos de processamento de sangue. Sugerimos que a metodologia anterior não refletir com precisão o efeito que o exercício tem na indução de morte celular em células do sistema imunológico ^7.

Utilizando a metodologia demonstrado aqui diminui a quantidade de sangue necessária para cada ponto de tempo de coleta. Além disso, nossa abordagem diminui amostra de processamento de tempo, o que pode reduzir a incidência de falsos positivos para a apoptose de linfócitos. Neste protocolo, o sangue total é adicionado ao painel de anticorpos dentro de 30 segundos após a coleta do sangue, reduzindo assim o potencial que os linfócitos progresso através do processo de apoptose e são eliminados antes da coloração de anticorpos. Este procedimento supera as limitações de medição discutido anteriormente, e permite a quantificação de linfócitos apoptóticos induzida pelo exercício como um estímulo fisiológico. Estudos futuros com relação a esta metodologia deve avaliar as diferenças de potencial com lancetas maior calibre.

Além disso, a metodologia descrita neste artigo permite a determinação do estágio precoce e tardia induzida pelo exercício apoptose em linfócitos (ver Tabela 1). Células marcadas com anexina V são apenas na fase inicial da apoptose, enquanto que a coloração dupla com anexina V e 7-AAD indicam progressão através do processo de morte celular para os últimos estágios. Células marcadas com 7-AAD só são indicativos de sofrer morte celular por necrose. Fenotipagem de linfócitos é realizada através de conjunto de marcadores de diferenciação (CD4 helper = linfócitos T, CD8 = citotóxico / supressor de linfócitos T, CD45RA = subfrações ingênuo, CD19 = B-linfócitos).