Punción en el dedo de sangre Metodología de muestreo para la determinación de la inducida por el ejercicio apoptosis de los linfocitos

1. Punción en el dedo de muestra de sangre

1. Recolección de sangre entera se toma típicamente en reposo por una medida de referencia (normalmente después de 10-15 minutos de descanso sentado), durante o inmediatamente después de una sesión de ejercicio, y durante todo el período post-ejercicio (por lo general a partir de 1-3 horas tras el cese de la ejercicio).
2. Utilizando las precauciones universales, en primer lugar esterilizar la yema del dedo con el 70% de alcohol isopropílico.
3. Punción A continuación, el sitio usando una lanceta automatizado o dispositivo similar. A pesar de que el uso de una lanceta de calibre 30 para proporcionar la comodidad tema, una aguja de calibre grande podrían ser utilizados.
4. Limpie la primera gota de sangre, y luego recoger la sangre en tubos capilares o microvettes tratados con heparina de litio para evitar la coagulación.

2. Fenotipo celular y la apoptosis de tinción

1. Añadir 10 l de sangre entera heparinizada al panel de anticuerpos tituló en 250 l de tampón de unión (véase el cuadro 1 esquema). Hemos utilizado un factor de dilución 1:20 con éxito, pero cada laboratorio debe su título de reactivos para determinar la mejor solución de trabajo.
   Tabla 1. Anticuerpos del panel para la determinación de la apoptosis inducida por el ejercicio en subconjuntos de leucocitos. Principios de la apoptosis se define por la expresión de anexina V, mientras que la apoptosis tarde fue definida por el doble etiquetado positivo con anexina V y 7-AAD. Las células necróticas se anexina V y 7-AAD + sólo las células.
   

   Un tubo	Tubo 2	Tubo 3	Tubo de 4
   Las únicas células del tubo	Anexina V - FITC	Anexina V - FITC	Anexina V - FITC
   	Contra CD4 Humanos - PE	Anti-CD8 Humanos - PE	Contra CD19 humano - PE
   	7-AAD	7-AAD	7-AAD
   	Humanos contra CD45RA - APC	Humanos contra CD45RA - APC

   
   7-AAD = 7-amino-actinomicina D, APC = aloficocianina, CD4 = linfocitos T, CD8 = supresor / linfocitos T citotóxicos, CD19 = linfocitos B, CD45RA = subconjuntos de células ingenuas, FITC = isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina = PE.
2. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
3. Centrifugar a 1075 g durante 5-10 minutos.
4. Se decanta, añadir 300 l Glóbulos Rojos tampón de lisis, y completamente vórtice.
5. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
6. Añadir 300 l de PBS para detener la reacción RBC lisis.
7. Centrifugar a 1075 g durante 5-10 minutos.
8. Se decanta, rack, y se añaden 50 l de tampón de unión.
9. Analizar por citometría de flujo.

Se recomienda que, como mínimo, los siguientes controles se utilizaron: un tubo de células sólo para servir como un control negativo en la detección de autofluorescencia de fondo, y tubos que contienen cada uno fluorocromo para ajustar la compensación de la preparación inicial del citómetro de flujo. Además, se han utilizado cuentas de compensación estándar con éxito para crear nuestros experimentos.

Un procedimiento de recogida de muestras de invasión mínima y su posterior análisis se demuestra en el análisis de las fases temprana y tardía inducida por el ejercicio de la apoptosis de los linfocitos. También es posible excluir con claridad las células, que son necrosis, apoptosis y no. Este procedimiento supera los inconvenientes y las molestias asociadas con la punción venosa invasiva de la región antecubital en múltiples momentos antes, durante e inmediatamente después del ejercicio, o asegurar un catéter para la duración de la sesión de ejercicio. En términos de los investigadores, estos procedimientos suelen requerir una formación especializada en la flebotomía, que no todas las personas tienen. Además, el reclutamiento de sujetos y la retención se espera que sea mayor con este procedimiento, lo que aumenta el poder potencial de estadística de encontrar un efecto significativo si uno está presente.

Investigaciones anteriores empleando muestras de sangre venopunción han informado valores de reposo y post ejercicio de los linfocitos en general. La utilización de anexina V, Simpson et al. Reportaron aproximadamente 1,2% de linfocitos apoptóticos en reposo, y ~ 1,3% después de correr ^una cinta de correr. Del mismo modo, Steensberg et al. Informaron ~ 1,8% total de linfocitos apoptóticos en reposo, y aproximadamente 2,1% después de 2,5 horas de funcionamiento ^2. Los resultados de linfocitos apoptóticos mediante el procedimiento de punción en el dedo aquí descritos son similares, con 0,7 ± 0,2% observado en el resto, y 1,1 ± 0,4% después de los ejercicios de cada cinco sujetos que completaron una prueba de esfuerzo (resultados no publicados).

Una de las limitaciones de la metodología anterior para determinar el ejercicio de la muerte inducida de células inmunes fue la cantidad de tiempo requerido para procesar una muestra de sangre. En investigaciones anteriores, las muestras obtenidas inmediatamente después del ejercicio por punción venosa fueron sometidos a un prolongado aislamiento y proceso de preparación (hasta 2 h) antes de ser finalmente evaluado por la muerte celular del ^3-5. Es razonable especular que las demoras de procesamiento puede elevar artificialmente informó después del ejercicio los valores de apoptosis de los linfocitos. En algunos casos, la anexina V linfocitos positivos han sido reportados a ser tan alta como 25% ~ ^6. Interpretación de esta confusión metodológica plantea la cuestión de si los valores reportados por apoptosis de los linfocitos se debieron al ejercicio o demoras de procesamiento de sangre. Sugerimos que la metodología anterior no reflejaba con exactitud el efecto que el ejercicio tiene en la inducción de muerte celular en células del sistema inmune ^7.

Utilizando la metodología ha demostrado aquí disminuye la cantidad de sangre necesaria para cada momento de recolección. Además, nuestro enfoque se reduce el tiempo de procesamiento de la muestra, que puede reducir la incidencia de falsos positivos para la apoptosis de los linfocitos. En este protocolo, la sangre entera se añade al panel de anticuerpos dentro de los 30 segundos después de la extracción de sangre, reduciendo así la posibilidad de que los linfocitos avanzar en el proceso de apoptosis y son eliminados antes de la tinción de anticuerpos. Este procedimiento supera las limitaciones de la medición se discutió previamente, y permite la cuantificación de los linfocitos apoptosis inducida por el ejercicio como un estímulo fisiológico. Estudio en el futuro con respecto a esta metodología debe evaluar las posibles diferencias con lancetas de mayor calibre.

Además, la metodología descrita en este trabajo permite la determinación de la etapa temprana y tardía inducida por el ejercicio de apoptosis en los subgrupos de linfocitos (ver Tabla 1). Células teñidas con Anexina V sólo están en la fase temprana de la apoptosis, mientras que el doble tinción con anexina V y 7-AAD indican la progresión en el proceso de muerte celular en las últimas etapas. Las casillas marcadas con 7-AAD sólo son indicativos de someterse a la muerte celular a través de la necrosis. Fenotipo de los linfocitos se logra a través de racimo de marcadores de diferenciación (CD4 = linfocitos T ayudantes, CD8 = citotóxico / supresor de los linfocitos T, CD45RA = subfracciones ingenuo, CD19 = B-linfocitos).