संशोधित Annexin सेल मौत के सटीक आकलन के लिए आयोडाइड वी / Propidium Apoptosis परख

Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. J. Vis. Exp. (50), e2597, doi:10.3791/2597 (2011).

सेलुलर apoptosis के अध्ययन में काफी प्रवाह cytometry आधारित विधियों की शुरूआत के बाद से प्रभावित किया गया है. Propidium आयोडाइड (पीआई) Annexin वी के साथ संयोजन के रूप में व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है निर्धारित करने के लिए अगर कोशिकाओं प्लाज्मा झिल्ली अखंडता ^और पारगम्यता 1,2 में मतभेद के माध्यम से व्यवहार्य, apoptotic, या परिगलित हैं. Annexin वी / पीआई प्रोटोकॉल apoptotic कोशिकाओं ³ अध्ययन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है . PI अन्य परमाणु दाग की तुलना में अधिक अक्सर इस्तेमाल किया जाता है क्योंकि यह किफायती, स्थिर और सेल व्यवहार्यता का एक अच्छा संकेत है और ^इसकी क्षमता कोशिकाओं 4,5 में रहने वाले डाई बाहर के आधार पर,. पीआई की क्षमता के लिए एक सेल में प्रवेश झिल्ली की पारगम्यता पर निर्भर है, पीआई रहते हैं या जल्दी apoptotic एक अक्षुण्ण ^{प्लाज्मा} झिल्ली 1,2,6 की उपस्थिति के कारण कोशिकाओं दाग नहीं करता है. देर apoptotic और परिगलित कोशिकाओं में, प्लाज्मा और परमाणु झिल्ली की अखंडता ^7,8 कम हो जाती है, PI झिल्ली के माध्यम से पारित करने के लिए, न्यूक्लिक एसिड में intercalate, और ^लाल प्रतिदीप्ति 1,2,9 प्रदर्शन की अनुमति है. दुर्भाग्य से, हम पाते हैं कि पारंपरिक Annexin वी / पीआई प्रोटोकॉल झूठी सकारात्मक घटनाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या (40%) है, जो PI ^{धुंधला} cytoplasmic 10 डिब्बे के भीतर शाही सेना के साथ जुड़े रहे हैं के लिए सीसा. (Cytoplasmic अनुपात: 0.5 <परमाणु) ^सबसे अधिक 10 घटना दिखाने के पशु मॉडल की एक विस्तृत रेंज में प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों, बड़े कोशिकाओं के साथ प्रभावित कर रहे हैं. इस के साथ साथ, हम एक संशोधित Annexin वी / पीआई विधि है कि कोशिका मृत्यु के पारंपरिक तरीकों की तुलना में मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता है प्रदर्शित करता है. इस प्रोटोकॉल के एक धुंधला निम्नलिखित कोशिकाओं में RNase के प्रवेश को बढ़ावा देने के लिए सेल फिक्सिंग के दौरान सेलुलर पारगम्यता में परिवर्तन का लाभ लेता है. दोनों समय और RNase की एकाग्रता किया गया है एक cytoplasmic शाही सेना को हटाने के लिए अनुकूलित. परिणाम पारंपरिक Annexin / वी PI प्रोटोकॉल (cytoplasmic PI धुंधला के साथ <5% की घटनाओं) पर एक महत्वपूर्ण सुधार है.

यह प्रक्रिया 500 μL siliconized ट्यूब या 6 एमएल polystyrene दौर नीचे FACS ट्यूबों में किया जा सकता है. बाद सामान्य रूप से जब अन्य प्रक्रियाओं के साथ संयोजन के रूप में व्यवहार्यता विश्लेषण ले जाने के लिए प्रयोग किया जाता है. दिया मात्रा 6 एमएल polystyrene दौर नीचे FACS ट्यूबों के लिए कर रहे हैं. 500 μL siliconized ट्यूबों के लिए, 1 / 5 सभी संस्करणों को कम.

प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए इष्टतम एकाग्रता 2-4 एक्स 10 200 μL मात्रा ⁶ प्रतिशत कोशिकाओं है . सेल नुकसान इस प्रक्रिया से परिणाम और इस तरह हम अनुशंसा करते हैं कि प्रत्येक नमूना प्रक्रिया के शुरू में 4 ^{x 10} 6 कोशिकाओं से मिलकर बनता है सकते हैं.

1. सेल तैयार

1. हार्वेस्ट कोशिकाओं इसी सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिका isolations के लिए विशिष्ट प्रक्रियाओं के लिए देखें.
2. 10 मिनट के लिए 335 x जी पर नमूने और अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला छानना.
3. 2 एमएल 1 एक्स फॉस्फेट में Resuspend कोशिकाओं खारा buffered (पीबीएस) ^{- / -} (नहीं, कैल्शियम, कोई मैग्नीशियम) .
4. 10 मिनट के लिए 335 x जी पर नमूने और अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला छानना.
5. 1 एमएल x 1 Annexin वी बाध्यकारी बफर में कोशिकाओं Resuspend.
6. 10 मिनट के लिए 335 x जी पर नमूने और अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला छानना.
7. 100 μL x 1 Annexin वी बाध्यकारी बफर में Resuspend कोशिकाओं.

2. Annexin वी / पीआई के आवेदन दाग

1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार Annexin वी जोड़ें [जैसे 5 μL Annexin वी Alexa 488 Fluor (आण्विक जांच, A13201)].
2. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ट्यूबों का सेते हैं.
3. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए 1 एक्स Annexin वी बाध्यकारी बफर के 100 μL जोड़ें. प्रत्येक ट्यूब में लगभग 200 μL होना चाहिए.
4. PI के 4 μL (सिग्मा, पी - 4864 - 10ml # बिल्ली) है कि 1 x Annexin वी बाध्यकारी बफर (यानी 1 9 μL 1 x Annexin वी बाध्यकारी बफर के साथ μL पीआई) में किया गया है 1:10 पतला जोड़ें. यह 2 / प्रत्येक नमूने में μg एमएल के एक अंतिम PI एकाग्रता निकलेगा.
5. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ट्यूबों का सेते हैं.
6. 500 μL x 1 Annexin वी बाध्यकारी बफर जोड़ें कोशिकाओं धोने.
7. 10 मिनट के लिए 335 x जी पर नमूने और अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला छानना.
8. 500 μL x 1 Annexin वी बाध्यकारी बफर और 500 μL 2% 1% formaldehyde (लगानेवाला) समाधान बनाने formaldehyde में Resuspend कोशिकाओं. कोमल flicking द्वारा ट्यूबों मिक्स.
9. ठीक 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने. वैकल्पिक रूप से, नमूने 4 में रात भर संग्रहीत कर सकते हैं ° C अंधेरे में. यदि बाद विधि चुना है, सभी ट्यूबों Annexin वी / पीआई (मुआवजा नियंत्रण सहित) के साथ लेबल भर में लगातार हो करने के लिए सुनिश्चित करें.
10. ^{/ -} प्रत्येक नमूने के लिए और धीरे मिश्रण flicking द्वारा 1 एमएल x 1 पीबीएस जोड़ें.
11. 425 x जी पर ट्यूबों आठ मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र छानना.
12. 2.10 और 2.11 कदम दोहराएँ.
13. ट्यूब flicking द्वारा गोली Resuspend.
14. 50 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता दे 1:100 पतला RNase एक (सिग्मा, R4642) के 16 μL जोड़ें. 37 पर 15 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
15. ^{/ -} 1 एमएल 1 x पीबीएस जोड़ें और धीरे flicking द्वारा मिश्रण.
16. आठ मिनट के लिए 425 x जी पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों.
17. नमूने अब विश्लेषण किया जा के लिए तैयार हैं है. वैकल्पिक रूप से, नमूने बाद धुंधला कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर Annexin / पीआई धुंधला अन्य प्रक्रियाओं के साथ समानांतर में प्रदर्शन किया जा रहा है.

3. प्रतिनिधि परिणाम:

प्रकार की कोशिकाओं और सेल लाइनों है कि झूठी सकारात्मक PI धुंधला की डिग्री बदलती है के उदाहरण चित्र 1 में दिखाया जाता है. झूठी सकारात्मक घटनाओं के लिए खाते के लिए, कोशिकाओं तय की और थे तो RNase ए के साथ इलाज यह परिणाम झूठी सकारात्मक घटनाओं की संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी में कोशिकाओं है कि RNase उपचार से गुजरना नहीं (चित्रा 2B) की तुलना में. चित्रा 2C कोशिकाओं है कि RNase उपचार कराना पड़ा की कोशिकाओं है कि नहीं RNase उपचार था की तुलना में प्रतिनिधि छवियाँ, से पता चलता है. चित्रा 3 से पता चलता है कैसे संशोधित Annexin वी / पीआई निर्धारण और RNase उपचार चरणों के साथ प्रोटोकॉल, झूठी सकारात्मक धुंधला घटनाओं की संख्या सीमित करके पारंपरिक प्रोटोकॉल के सुधार पर है.

चित्रा 1. परम्परागत propidium आयोडाइड धुंधला प्रोटोकॉल झूठी सकारात्मक घटनाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या के लिए नेतृत्व हम पहले पशु मॉडल की एक व्यापक रेंज भर के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेल ¹⁰ लाइनों की एक किस्म में प्राथमिक कोशिकाओं भर में झूठी सकारात्मक धुंधला की हद तक का मूल्यांकन .. प्रतिनिधि छवियों तीन अद्वितीय सेल आबादी (रॉ मैक्रोफेज और दो प्राथमिक कोशिकाओं - murine अस्थि मज्जा (BMM) मैक्रोफेज और सुनहरीमछली प्राथमिक गुर्दे मैक्रोफेज (PKM) आमतौर पर इस्तेमाल किया सेल लाइन) में झूठी सकारात्मक धुंधला की हद तक दिखाते हैं. सच सकारात्मक घटनाओं की उम्मीद PI और DRAQ5 के बीच परमाणु डिब्बे के भीतर सह स्थानीयकरण (पीले क्षेत्रों PI और DRAQ5 के बीच colocalization चित्रित) प्रदर्शित करते हैं. DRAQ5 अत्यधिक membra हैपूर्वोत्तर पारगम्य रंजक है कि दोनों जीवित और मृत ^10,11,12 कोशिकाओं में सही दाग परमाणु डिब्बे. आसान DRAQ5 colocalization के दृश्य निर्धारण के लिए दाग एक हरे रंग की pseudocolour दिया गया था.

चित्रा 2. PI परमाणु धुंधला की सटीकता में सुधार . (ए) हम PI परमाणु अच्छी तरह से विशेषता परमाणु दाग ​​(BrdU, 7-AAD और DAPI) के एक नंबर के DRAQ5 समानता की डिग्री पर आधारित धुंधला की सटीकता का मूल्यांकन. BrdU एक कृत्रिम न्यूक्लीओसाइड कि proliferating कोशिकाओं के डीएनए में शामिल है, और जैसे ही परमाणु डिब्बे के भीतर दाग है. 7 - AAD डीएनए के लिए एक उच्च आत्मीयता और, पीआई के लिए इसी तरह की है, एक अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्ली को पार नहीं कर सकते. DAPI भी डीएनए के लिए एक मजबूत संबंध है और सबसे अधिक इस्तेमाल किया परमाणु फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में दाग. समानता की डिग्री BrdU, 7-AAD, DAPI और DRAQ5 के बीच> 99% था, उनके सही रॉ 264.7 मैक्रोफेज में सेल नाभिक दाग की क्षमता पर प्रकाश डाला. इसके विपरीत, cytoplasmic PI पारंपरिक प्रोटोकॉल पर आधारित धुंधला प्रतिशत DRAQ5 करने के लिए सापेक्ष धुंधला की समानता में एक चिह्नित कमी करने के लिए होता है. Murine अस्थि मज्जा (BMM) मैक्रोफेज और सुनहरीमछली प्राथमिक गुर्दे मैक्रोफेज (PKM): (बी) इसी तरह के परिणामों के दो प्राथमिक परीक्षण कोशिकाओं में मनाया जाता है. 50 μg / एमएल RNase धुंधला प्रक्रिया के भीतर विशिष्ट स्तर पर एक गैर परमाणु निगमन PI धुंधला निकालता है और काफी समानता की डिग्री DRAQ5 धुंधला के सापेक्ष बढ़ जाती है. (सी) प्राथमिक गुर्दे मैक्रोफेज के प्रतिनिधि छवियों के साथ और RNase उपचार के बिना कोशिकाओं के लिए समानता की डिग्री दिखा. आसान उपचार के बीच मतभेद के दृश्य दृढ़ संकल्प के लिए, DRAQ5 एक हरे रंग दिया गया था. पीला क्षेत्रों BrdU और DRAQ5, और PI और DRAQ5 के बीच colocalization चित्रित.

चित्रा 3. संशोधित Annexin वी / पीआई काफी झूठी apoptosis / परिगलित घटनाओं को कम कर देता है. प्राथमिक सुनहरीमछली गुर्दे मैक्रोफेज (PKM) पारंपरिक और संशोधित Annexin वी / पीआई प्रोटोकॉल के साथ दाग रहे थे. Scatterplots चित्रित Annexin वी / पीआई सुनहरीमछली PKM में दाग. बाईं तरफ scatterplot PKM कोशिकाओं के पारंपरिक Annexin धुंधला / वी PI (नहीं RNase) से पता चलता है. दाईं तरफ scatterplot PKM संशोधित Annexin वी / पीआई प्रोटोकॉल (RNase के साथ) के साथ दाग कोशिकाओं से पता चलता है. PI झूठी सकारात्मक दाग को हटाने के लिए कारण धुंधला हो जाना के एक चिह्नित कमी में RNase परिणाम के अलावा. PKM कोशिकाओं तो संस्कृतियों - जल्दी progenitors के भीतर अलग आबादी (EP), (मोनो) monocytes और परिपक्व मैक्रोफेज (चटाई मैक) पर आधारित विश्लेषण थे. सकारात्मक PI घटनाओं की संख्या में कमी, झूठी सकारात्मक घटनाओं को हटाने की वजह से बड़े परिपक्व बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं में छोटे जल्दी पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की तुलना में अधिक स्पष्ट है. पारंपरिक प्रोटोकॉल पर आधारित निष्कर्ष ग़लती से अधिक परिपक्व बृहतभक्षककोशिका सबसेट के लिए एक सेलुलर मौत में सकारात्मक सहसंबंध का सुझाव दिया होता.

Annexin वी / पीआई प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत पारंपरिक प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण है और cytoplasm जो भी पीआई के लिए उच्च संबंध है में शाही सेना की उपस्थिति के खाते में लेता है. RNase 1% formaldehyde निर्धारण धुंधला हो जाना प्रक्रिया में देर से कदम के बाद एक (50 μg / एमएल) का परिचय काफी परमाणु PI धुंधला की सटीकता में सुधार. कोई नकारात्मक प्रभाव परमाणु PI धुंधला हो जाना या प्लाज्मा झिल्ली Annexin वी धुंधला में मनाया जाता है. RNase एक इलाज के बिना, PI दाग परिणाम के 40% अप करने के लिए झूठी सकारात्मक घटनाओं, जो ^बहाव 10 निष्कर्ष पर एक संभावित महत्वपूर्ण और नकारात्मक प्रभाव की ओर जाता है करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

हमारे संशोधित Annexin धुंधला वी / पीआई प्रोटोकॉल सरल है और प्रभावी ढंग से सेल प्रकार (प्राथमिक कोशिकाओं के एक विस्तृत रेंज में इस्तेमाल किया गया: murine अस्थि मज्जा मैक्रोफेज और splenocytes, स्वाइन फेफड़ों निवासी कोशिकाओं, फेफड़ों वायुकोशीय मैक्रोफेज, mesenteric लिम्फ नोड आइसोलेट्स, परिधीय रक्त leukocytes splenocytes, चिकन blastoderm कोशिकाओं, सुनहरीमछली प्राथमिक गुर्दे मैक्रोफेज, कार्प परिधीय रक्त leukocytes, सेल लाइनों: रॉ 264.7 मैक्रोफेज, Jurkat टी कोशिकाओं, सूअर 3D4/31 मैक्रोफेज, सीसीएल-71 ज़र्द मछली फिन fibroblasts, 3B11 कैटफ़िश बी ¹⁰ कोशिकाओं). यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं विभिन्न प्राथमिक कोशिकाओं आम तौर पर ^झूठी सकारात्मक 10 घटनाओं की एक बड़ी संख्या होने के साथ झूठी सकारात्मक PI धुंधला हो जाना, से प्रभावित कर रहे हैं है. इन सेलुलर आबादी के बीच मतभेदों को झूठी सकारात्मक PI धुंधला सेल आकार में अंतर करने के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, लेकिन शाही सेना सामग्री में मतभेद से भी परिणाम हो सकता है. के रूप में इस प्रक्रिया के इस तरह के समावेश, प्रायोगिक प्रणाली है कि का उपयोग दूसरों के बीच, genotoxic तनाव के दौर से गुजर कोशिकाओं, सेल चक्र गिरफ्तारी thymidine या hydroxyurea जैसे दवाओं, virally संक्रमित कोशिकाओं, और जहां भ्रूण विकास प्रगति कोशिकाओं पर अध्ययन के साथ इलाज किया कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है सेलुलर शाही सेना संश्लेषण में असतत परिवर्तन द्वारा विशेषता है.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

इस अध्ययन में एक प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग परिषद कनाडा () NSERC अनुसंधान अनुदान और एक अलबर्टा कृषि अनुदान कंसोर्टियम DRB अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. AMR एक NSERC Vanier कैनेडियन स्नातक छात्रवृत्ति, अलबर्टा शिक्षण assistantship और महारानी एलिजाबेथ द्वितीय स्नातक छात्रवृत्ति के एक विश्वविद्यालय के माध्यम से समर्थित है.

1. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., & Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods 184, 39-51 (1995).
2. Vermes, I., Haanen, C., & Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods 243, 167-190 (2000).
3. Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., & De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis 7, 41-47 (2002).
4. Fried, J., Perez, A.G., & Clarkson, B.D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol 71, 172-181 (1976).
5. Bacso, Z., Everson, R.B., & Eliason, J.F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res 60, 4623-4628 (2000).
6. Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M.A., Lassota, P., & Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry 13, 795-808 (1992).
7. Kroemer, G., Dallaporta, B., & Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
8. Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., & Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
9. Faleiro, L. & Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol 151, 951-959 (2000).
10. Rieger, A.M., Hall, B.E., Luong, L.T., Schang, L.M., & Barreda, D.R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods 358, 81-92 (2010).
11. Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells 27, 391-396 (2009).
12. Njoh, K.L., Patterson, L.H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R.J., & Smith, P.J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A 69, 805-814 (2006).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.