新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

1。スライシングの日前の準備

我々は、それは手術器具をオートクレーブし、前のスライスの日に溶液を調製する方が効率的です見つける。

1. オートクレーブの楽器。 （手術とスライスが半無菌条件下で行われる）。個々にオートクレーブ紙に包んで次のパッケージを、オートクレーブ。
   • 手術のパッケージ：へら、＃22手術用メスの刃のハンドル、はさみ、ピンセット
   • パッケージスライス：3ノブを（ブレード保持のノブと2バス-確保ノブ）とブレードガード（スライサーからかみそりの刃保持する：カムデンVibroslice、＃MA572）を、個別にラップ（それは冷凍庫に入れてしまうので）カスタムメイドの金属製容器（スライサー（一繰り返しオートクレーブに耐えられないだろう、メーカーのプレキシガラス）、止血鉗子、はさみ、鉗子のための試料風呂）。
   • ガラス製品のパッケージ：2個の50 mLのビーカー一25mLのビーカー
2. 注しウマ血清（Hycloneドナーウマ＃SH 30074：Thermoscientic）。一定分量〜15 mLコニカルチューブに馬血清11 mLの。 （10mLの血清が必要である。融解したと​​きの血清気泡が形成されるので、必要な10 mLを吸引するから11 mLを必要）。ストアは、-20℃の冷凍庫で血清分注した。
3. アリコートメディア。メディアのボトルが開かれた後、彼らは〜4週間（pHの変化による）のためにのみ安定している。スライスは、新鮮な培地で良く生き残る。
   • 我々は、市販のメディア（500 mLボトルで購入）、加えて馬の血清の3つのタイプを使用してください。メディアは以下のとおりです。HMemの（ロンザBiowhittaker最小必須培地を加えたHBSSとHEPES、無グルタミン：カタログ＃12 - 137F）、HBSS（GIBCOハンクスは生理食塩水、＃24020から117をバッファリング）、およびMEM（GIBCO最小必須培地、＃12360 - 038）。表2を参照してください。
   • メディア（HMemの、HBSS、およびMEM）の3つのタイプのそれぞれについて、一定量〜4つの50 mLコニカルチューブの各々へのメディアの500mlボトルから50mLの。小分け後のパラフィルムは、すべてのチューブ。冷蔵庫で保管してMEM、および店舗HMemのと、室温でHBSS。
   • 培地は、ウマ血清、HMemの、そしてHBSS（下記参照、表2）の混合物で構成されています。 MEMは、洗浄媒体として使用されます。
4. （表3）ソリューションを切断してください。 NaClを125、KClの3、のNaH ₂ PO ₄ 1.25、NaHCO _3の 26、2mMのCaCl _2を 、2mMのMgCl _2、及び20mMグルコース：カッティングソリューションは（mMで）で構成されています。我々は通常、250 mLの（メスフラスコの容積をもたらす）こと。浸透圧を確認してください（〜310でなければならない）とpH（7.2〜7.3）。

以降の手順は、（＃2と＃3）スライスの日に実行されます。

2。手術、スライス、および器官文化

他のすべての手順対別の場所で手術を実行することが重要です。我々は、脳の除去のための手術のために真空（ヒューム）フードを使用。層流フードは、スライスとスライスとソリューションの操作のような半無菌条件下で行う手続きのために使用されます。

1. 溶液を調製。 （これらの手順は、ソリューションは後のステップでフィルタリングされるように、無菌条件下で行う必要はない。）。
   1. カッティングソリューション（表3）を準備します。バブル95％の混合O ₂ /少なくとも20分間、5％CO _2（pHを安定させ、すべての塩は、ソリューション内にあることを確認する）と解決策。 1mMのピルビン酸（代謝阻害剤）and0.6 mMのアスコルビン酸（酸化防止剤）を追加します。
   2. ウマ血清（11 mL）を1アリコートを解凍。
2. （EtOHで手袋を飽和させる、すべての手続きのために手袋を着用）層流フードを準備します。このセクションでは、我々は、クリーン、半滅菌作業空間を提供するために、作業領域を準備する。我々はまた、それらを滅菌するためのソリューションをフィルタします。
   1. 層流フード内の作業領域を滅菌するために〜1時間UV光を使用して、（我々はtheCampden VibrosliceをカバーするようにUV光が我々のスライス用に使用するプラスチック部品に損傷を与える、以下を参照）。 （：エタノールが損傷することがスライサーのプラスチックノブを除く）70％EtOHですべての面を清掃してください。層流フードの下でも、通常は現在の95％O ₂ / 5％CO _2、100 O ₂に接続ピペッターやピペット、エタノールのボトル、接着剤、及びチューブがあります。
   2. 層流フードの下に以下のファイルを格納します。
      • オートクレーブスライスパッケージ
      • 250mLのカッティングソリューション
      • ミリポアエクスプレスプラスフィルター：250mLの[0.2μmのフィルターは、（＃SC6PU02RE）カッティングソリューションをフィルタリングする]：
      • 文化メディアコンポーネント：
        • 20 mLのHMemの
        • 10 mLのHBSS
        • 10mLのウマ血清
      • ガラス製品のパッケージ：高圧蒸気滅菌ビーカー
      • MEM洗浄培地50 mLの
      • ピペッター（ドラモンドピペットエイド）
      • 七プラスチック転送ピペット（フィッシャー＃13-711-20）。ソリューションとメディアをバブリングするため、これらは、スライスやソリューションだけでなく、ガスのソリューションのための導管として機能する（95％O ₂ / 5％CO ₂ O _2）を転送するために使用されています。
      • シアノアクリレート接着剤
      • かみそりの刃やはさみ（プラスチックをカットする）。
      • 滅菌＃22手術用メスの刃
      • Millicellの細胞培養用インサート（0.4μmの、30μmの直径、＃PICM 03050）各6ウェルプレート3を挿入
      • 6ウェル培養プレート（S）（コーニング：コスター＃3516）
   3. 250 mLのミリポアフィルターを（上記参照）を使用してプリペアド250mLのカッティングソリューションをフィルタリングします。
      50 mLのビーカーに溶液を切削物のアリコートを40 mL。冷凍庫でのソリューションと210 mLの残りのカッティングソリューションを切削40mLのアリコート（-20℃）を置きます。目標は、〜4℃で頭蓋骨（ビーカー40 mL）から除去した後、脳を受信したり、カット（210 mL）を用ぬかるみの混合物として、これらのソリューションを使用することです。
   4. -20℃の冷凍庫内の場所の金属スライスチャンバー（オートクレーブの紙で覆われている）。これは、スライス間に切断ソリューションと脳の寒さを維持するのに役立ちます。
   5. 文化メディアを準備して、井戸（バブル文化メディアをしないでください - それは泡の意志）に入れ。
      • 50 mLのプラスチック遠心管に40 mlの培養液のメディアを準備します。
        • 20 mLのHMemの+ 10 mLのHBSS +ウマ血清を10 mLずつを（表2）ミックス
        • 50 mLのミリポアsteriflip0.22μmのフィルターを（＃SCGP00525）を使用してフィルタの文化メディア（殺菌する）。
      • 6ウェルプレートの3斜めに等間隔井戸（：コスター＃3516 6ウェル培養クラスタコーニング）に行わ1.1 mlの文化メディアを。 37に代わり、6ウェルプレート/文化メディア少なくとも1時間℃のインキュベーター。
   6. 滅菌済みのハサミかカミソリの刃で、転送ピペットの4（スライスの転送に使用する）短縮。カットチューブの端部は、バブルのソリューションのためのガスを分散させるためにさらに変更を加えることなく使用されています。これらのチューブは、95％O ₂ / 5％CO ₂または100％のソリューションへのO ₂のタンクからのラインを接続する。
   7. フィルタウォッシュメディア（50mL）に50mLのミリポアsteriflip0.22μmのフィルターを（＃SCGP00525）を使用して。冷蔵庫で洗浄メディアを置きます。
3. 手術のための準備。ソリューションは、手術後の脳（真空フードを）受け入れることとスライスと文化のための準備（層流フード）急速できるように準備する必要があります。我々は真空のボンネットの下に手術を行う。手術を離れて半無菌層流フードの毛や体液を保つために別の領域で実行することが重要です。
   1. メディアとの溶液を調製。
      • 冷凍庫から40mLの切削液を50 mLのビーカーを取り出して、頭蓋骨から除去した後、脳を受信するために真空フードの下に置く。 25mLのビーカーにこの冷たい切削液の約10 mLを注ぐ。これは、層流フードへの脳を転送するために使用されます。
      • 冷凍庫から210 mLの切削液を除去し、層流フード（コレクションをスライスし、スライス用）に入れ。
      • 冷凍庫から金属スライスチャンバーを取り外して、層流フードの下に置く。
      • 95％O ₂ / 5％CO _2（ソリューションにチューブを接続するためにカットプラスチック製トランスファーピペットを使用）とバブルの両方最先端のソリューションを。
   2. 真空フードの下に以下の項目を（30 mLのカッティングソリューションは既に95％O ₂ / 5％CO ₂で存在し、バブリングです）に置きます：
      • 25mLのビーカーをオートクレーブ
      • オートクレーブ手術器具、手袋、鉗子
   3. 100％O _2（ソリューションにチューブを接続するためにカットプラスチック製トランスファーピペットの先端を使う）と冷蔵庫とバブルからメディアを洗って取り外します。
4. 手術（真空流フードの下で実行）。このステップは、スライシング、後続のために脳を除去する必要がある。動物を犠牲にして寒さ、酸素切断ソリューションで脳を配置するまでの時間を最小限に抑えることが重要です。脳に外傷を最小限に抑えることも重要です。すべての手順は、動物実験委員会、テネシー大学、健康科学センターによって承認された。
   1. 我々は（我々はP8 - P10を好む）P6 - P17から、Sprague - Dawleyラットを使用してください。対象となる2月4日Lのプラスチック容器に入れますラット。麻酔の場合は、〜1 mLのイソフルランは、プラスチック製のメッシュ（麻酔が動物に接触しないように）下にあるガーゼの部分に適用されます。動物がareflexiveになるまで、イソフルランでラットを麻酔。 EtOHで手袋を飽和させる。
   2. ラットに麻酔をした後に、大きなメスで動物を刎ねる、そして脳を取り外します。に脳を置くコー​​ルド30mLを入れたビーカー（〜4℃）〜30秒間切断ソリューション。慎重に脳は、層流フードへの髪の毛や血液の転送を最小限に抑えるために25mLのビーカーに移す。
   3. 手袋を変更する（EtOHで飽和）。
   4. 層流フードへのコールドカットソリューションで転送脳（25 mLビーカー）。
5. 脳をスライスし、培養のために準備する。このステップでは、我々東洋の脳は、不要な脳組織を除去し、脳のスライスを切り取って収集する。私たちは、その後のスライスを洗って、メッシュインサート上の各スライスを配置する、6ウェル培養プレートにメッシュインサートを配置し、文化のためにインキュベーターにプレートを（スライスで）転送する。
   1. 各半球から一 - - 。オリエントとブロックの脳は、（小脳および前頭極を削除、これは、2つのスライスの同時加工を可能にする部分的なミッド矢状カット〜前頭皮質の端から半分の方法を作るが、それでもために尾方端で一緒に両方hemsipheresを保持ステージへの接着剤に安定したベース）。接着剤はシアノアクリレートとステージ上で脳を遮断した。前頭皮質と脳を置き、frontoparietalの皮質の冠状スライスを切る。としてスライスのサイズを制限するために必要な追加のメスカットを行います。
   2. 滅菌金属スライスチャンバー（振動組織スライサーに接続されている）に脳にステージを配置し、切削のソリューションをバブリング、氷冷でお風呂を埋める。 95％O ₂ / 5％CO ₂で50 mLのビーカー（スライスを収集する）と、バブルに残りの切断ソリューションの〜30mLを注ぐ。
   3. 振動組織スライサー（：世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州、米国カムデンVibroslice＃MA572）で250〜300μmのスライスを切る。 30mLのカッティングのソリューションが含まれているビーカーに入れますスライス。あなたが文化（通常は3-6）を希望するスライスの数、プラスいくつかの追加を収集する。
   4. 35mmプラスチックシャーレにプレース〜2 mLの洗浄メディア：スライスを洗ってください。カッティングソリューションから洗浄メディアを持つプラスチック製ペトリ皿にすべてのスライスを転送する。新鮮な洗浄メディアを毎回使用して、スライスを3回洗浄する。 、スライスを転送するメディアを追加し、廃液を吸引するために別の転送ピペットを使用してください。
   5. （;新しい転送ピペット異なる35mmプラスチックシャーレ内）文化メディアにスライスを転送する。メッシュを挿入するためのパッケージからトップを外しますが、包装に挿入しておきます。
   6. インサート（図1A）の中央に位置スライス：培養培地からメッシュインサート（cuttransferピペット付き）へ転送スライス。文化メディアの小さなビットは、スライスと一緒に来る。そのまま転送ピペットを用いて、挿入時にスライスを配置した直後に過剰な文化のメディアを削除します。 （これは遺伝子銃トランスフェクションを促進し、後で簡単に録音用のスライスを削除するために行う）インサートの中心にスライスを配置してみてください。
   7. 6ウェルプレートの培養培地中のメッシュインサート/スライス（図1B）を配置。 mesh.When 3挿入/スライスの下に気泡の形成を防止するように注意してください6 - ウェルプレート、場所インキュベーター内で6 - ウェルプレートの後ろにある。 〜1時間37℃のインキュベーター内のスライスをインキュベートする。
6. 遺伝子銃を用いてトランスフェクションのスライス（Bio - Rad社のヘリオス）。これは、6ウェルプレートにスライスし、メッシュ上に配置した直後に行うことができます、しかし、我々は通常、37℃で1時間インキュベート° Cは、スライスを安定化し、細胞をトランスフェクトする。 cDNAを"弾丸"を作り、遺伝子銃を使用するための詳細なプロトコールについては、文献を参照してください。 17から22。
   1. "弾丸"を含むプラスチック製の"cartidges"をロードします。 （私たちは、弾丸のようにcDNAをコーティングした金粒子を参照してください。従って、多くの弾丸はプラスチック製の"カートリッジ"に含まれている。）。最初の位置フリー（無"カートリッジ"）のまま。カートリッジは、cDNAをコーティングした弾丸を含有する他のすべての位置を読み込みます。遺伝子銃のカートリッジホルダーに置きます。
   2. のないカートリッジでバレルを焼成して透明な銃。
   3. カートリッジとのいずれかにバレルを進める。層流フードの下インキュベーターと場所から6 - ウェルプレートを取り外します。ちょうど6ウェルプレートの上部の上に銃を保持する。垂直ホールド。 〜100 psiで撃つ。
   4. アドバンスバレル、明確な、繰り返し。一つは、スライスごとに撮影。
   5. 撮影後、インキュベーターにスライス/インサートで6 - ウェルプレートを返します。
7. 文化のスライス（半無菌条件下で）。スライスと6ウェルプレートのすべての操作は、EtOHでエリアをクリーニングした後、EtOHでおよび層流フードの下で飽和手袋を着用して行う必要があります。我々は、文化、様々な期間（一般的には2-7日）のスライスが急性スライスプロシージャからの回復を可能にし、新しい蛋白質につながるとトランスフェクションのための時間を許可する。
   1. 2-7日の培養（37℃、5％CO _2）インキュベーター内（フォーマ科学モデル＃3110）。
   2. 一日おきにメディアを交換してください：少なくとも1時間インキュベーターに置き換え、三空いているウェルに新しいメディアを追加します。 EtOHで洗浄さ曲がったピンセットで新しいウェルにスライス/膜を移動します。吸引する古いメディア。インキュベーターにプレートを返します。

3。スライスにおける錐体細胞からの記録

それは、全細胞記録技術に関する詳細なインストラクションを提供するために、このプロトコルの範囲を超えています。我々は録音室にスライスを転送し、私たちの記録の詳細を提供する方法に関する情報を提供する関係は、録音のためにトランスフェクトされた細胞を識別するために、特にとして、セットアップ。

1. 我々は、サターP - 87水平プラーを使用して、ハーバードGC150TF - 10ガラスからの電極を引き出します。電極は細胞外液中にMΩ2-6されています。電極はKMeSO _4つの内部（表3参照）で埋められます。
2. 手袋を着用してください。インキュベーターから6 - ウェルプレートを取り外します。層流フードの下に、慎重にエタノール洗浄を、湾曲鉗子とつのスライス/メッシュカバーを取り外します。インキュベーター内で6 - ウェルプレートを交換し、記録領域にから記録されるスライスを転送する。私たちの場合、これは別の研究室にあります。我々は、対象となる35mmのプラスチックシャーレ内に挿入/スライスを運ぶ。このステップの後、手袋が（文化やインキュベーターの汚染の可能性）に着用する必要はありません。
3. ＃11メスで膜を切り取る。鉗子や柔軟な金属製の棒によって供給される緊張に対してカット。 （これは、ハサミで最終カットを完了する必要があるかもしれません）。鉗子を使用して、オリンパスBX50ウィスコンシン州正立顕微鏡のステージ上の記録室に接続されたメッシュでスライスを転送する。
4. 我々はPClamp 10の軸索インスツルメンツMulticlamp 700Bアンプとデータ収集プロトコルを使用してください。電極の位置は、サッタROE - 200マニピュレータとPC - 200コントローラで制御されます。我々は、我々は可視化するために、単一の赤外線感度カメラ（オリンパスOLY - 150またはDAGE - MTI）とP​​roVideo 1201Bのモニターを使用するレイヤーII / IIIまたはVの錐体細胞を可視化するためにIR - DIC光学系でオリンパスBX - 50WI正立顕微鏡を使用してくださいスライス内のセル。 33 ± 1℃で2〜3 mL /分で供給：スライスを人工脳脊髄液（表3 ACSFを）carbogenatedを浴びている
   一般的に、我々は、スライスごとに10〜50トランスフェクションされた細胞を見つける。細胞はlookingthrough顕微鏡の接眼レンズをとFITCフィルター（目標を超えると、顕微鏡の接眼レンズ下にあるタレットマウントのフィルタホイールにマウントされている）で落射蛍光を使用して配置されています。これは、私たちは容易に細胞をトランスフェクションされているセルの種類を、（セルは、落射蛍光下で緑色に表示されると弾丸を含む）を決定するためにIR - DICと落射蛍光を切り替えることができます、そして、細胞が健康であること（細胞は3次元であり、滑らかな表面を有する、核ではない腫れ、細胞が腫れたり、縮小されていない）。
   我々は、層II / IIIまたはVの錐体細胞（図1を参照）ターゲット。錐体細胞が層に向かって私、多数の樹状突起、および洋ナシの形をしたソーマを昇順先端樹状突起の存在によって識別されます。層は、細胞密度とぴあからの相対位置によって決定されます。スライスの表面上に一般的にトランスフェクトされた細胞は、健康にはなりません。それは急性スライスと比べて器官スライス内の深い細胞を可視化することは困難であるが、我々は一般的にスライス面下20〜50μmから健康、トランスフェクションされた細胞を可視化することができます。我々は標準的な全細胞記録の方法を使用してください。我々は、視覚的な指導の下、電圧クランプの正圧とセルに近づく。シールは、電圧クランプの下で穏やかな吸引（1 mLのシリンジを使用）で取得されています。 GΩシールを達成する際に、追加の吸引が細胞に侵入するために適用されます。我々は、その後の電流または電圧クランプのいずれかで録音を行います。
   録音の最後に、我々が記録された細胞が緑色であることを確認し、弾丸を含んでおり、目に見えて、負または正圧に応答します。スライス、細胞層、手術時の年齢、そして文化の中で時間との間の変動を制御するために、我々は常に同じ層からトランスフェクトされていないコントロール細胞からの録音でトランスフェクトした細胞の私達の録音をペアにし、トランスフェクトされた細胞の50μmのと同じ場所にある。

4。代表的な結果：

図1Aは、培養用6ウェルプレートに挿入するために、膜の上に座って鋭く準備スライスを示しています。このスライスは、子犬P10のラットから運動と体性感覚野が含まれています。 PIAは、左に白質と線条体で、図の右側にあります。図1Bは、〜1.1 mLの培養培地中に浸漬スライス/ウェルのメンブレンを、示しています。器官培養のための我々の目標は、大脳皮質の正常な層流のパターンを保持する場合、培養中に乾燥表面を防止し、最終的に記録することができる文化の中で数日後に、スライスの生細胞の割合が高いを生成する（細胞はまたは縮小しない腫れ、最小限の腫れ細胞核、IR - DIC光学における細胞の光沢のある三次元の外観）。図1Cは、3日後に体性感覚野の器官型スライスの層III錐体ニューロンのIR - DICと落射蛍光画像を示しています。文化（P10の動物から）。図1Dは、GFP（緑色の細胞）のcDNAをトランスフェクトしたいくつかの層のVの細胞を示す、別のスライスの落射蛍光像である。

図2は、3日間（P10動物）のための器官スライス培養後のV層錐体細胞からの電流と電圧クランプ記録の代表的なトレースを示しています。図2Aは、オーバーシュートの活動電位（AP）を示します。図2Bは、400 pAの定電流注入、2秒に対応して反復的な発火を示しています。これらのトレースは、通常のスパイクV層ニューロンの正常な電気生理学的特性を（表1も参照）を示します。図1Cは、電位依存性Na ⁺電流をブロックするように1μMのテトロドトキシン（TTX）の存在下でV層錐体ニューロンからの電圧クランプ記録です。トレースは-90 mVと70 mVの（ステップの間に10 mVの時）の間に様々な電位の70mVの保持電位から500 msの電圧のステップに応答して電流の家族です。

図1。器官スライス培養。A. Millicellフィルターメッシュインサート上でP10のラットからラット感覚運動皮質のスライス。ぴあは、右から左へ、深部白質、線条体にすることです。正中線は上端にあります。 B.三スライスとメッシュインサート〜1 mLの培養培地に浸漬し、6ウェルプレート（同じ動物）の隣接しないウェルに配置。 C. IR - DIC（上段）と（下）器官培養中の層III新皮質の錐体細胞（P10、動物、文化の中で3日間）の画像をepifluoresent。 DIC画像（黒球）の目に見える"弾丸"に注意してください。 GFPのcDNAと遺伝子銃トランスフェクション後、いくつかのV層のニューロンのD.蛍光画像。

図2。器官スライス培養における新皮質の錐体細胞からの記録。A.閾値上10ミリ電流注入に応答して、レイヤーIII錐体細胞における活動電位（P10の動物から、文化の3日後）。 2秒、400 pAの電流注入に応じてさまざまな、V層錐体ニューロン（P10ラット、培養中の3日間）からB.繰り返し発射。これは、通常のスパイキングニューロンだった。別のV層錐体ニューロン（P10ラット、培養中の3日間）からC.電圧クランプ記録。 1μMのTTXは、電位依存性Na ⁺電流を遮断するために存在していた。外側、K ⁺ -70 mVの（プロトコル右の）の保持電位から500 msの電圧ステップの家族への応答の電流。電圧は、+10 mVの液間電位を補正した。アクセス抵抗はMΩ〜9であった。直列抵抗や膜容量の補償が採用されなかった。

表1。制御対GFP -トランスフェ錐体細胞 （;： 試験管内で 3-4日間器官スライスP10ラットからスライス） の類似の電気特性 。意味+平均の標準誤差（セル数）。 RMP =静止膜電位、RN =入力抵抗、AP =活動電位、APのVth =電圧のしきい値、片振幅でHW = APの幅。

表2。商業メディア。これらのメディアは（彼らの組成物が製造業者からオンラインで利用可能な）無修正購入して使用されています。

¹ウォッシュメディア：MEM（GIBCO＃12360）
文化メディア：20mLのHMemの^1（ロンザBiowhittaker）、+ 10mLのHBSS1（ギブコ、24020〜117）+ 10mLの馬serum1（Hyclone＃SH 30074.03）

表3。ソリューション （mMで濃度）。

125のNaCl、3 KClを、2のCaCl _2、2のMgCl _2、1.25のNaH ₂ PO _4、26のNaHCO _3、20グルコース液（pH7.4、310 MOsm / L）：解決策をカット 。
人工脳脊髄液ACSF（外部録音）：125 NaClを、3のKCl、2のCaCl _2、2のMgCl _2、1.25のNaH ₂ PO _4、26のNaHCO _3、20グルコース液（pH7.4、310 MOsm / L）。
内部録音（電流クランプ）：130.5 KMeSO4、10のKCl、7.5塩化ナトリウム、2のMgCl _2、10 HEPES、2 ATP、0.2 GTP、0.1 EGTA（pH 7.2の、285から295 mOsm / L）。
内部録音（電圧クランプ）：55 KMeSO _4、55 KOH、2のMgCl _2、20 HEPES、6クレアチンリン酸、4 ATP、0.5 GTP、10 BAPTA、0.1ロイペプチン液（pH7.2、285から295 mOsm / L）。

我々は、ラットの大脳新皮質（4、9-11）から錐体ニューロンにおける電位依存性カリウムチャネルの発現と機能的役割を研究している。なぜなら、これらのチャネルの特定の薬理学的作用物質の不足のため、我々はチャンネル式（1,14,15,17-19）を操作するための遺伝学的アプローチを使用してください。我々は、器官培養の準備（; 5月8日、2,3 12,13,15-22）利用する。Stoppiniらのアプローチから変更を（16）、細胞の形態と皮質の層のパターンを維持するために。我々は、6月17日出生日で急性最近、大脳皮質を分離して2-7日培養でスライスを維持する。これは、私たちは、急性スライスを使用して我々の仕事と同様な高齢者の神経細胞を研究することができますし、スライスにあふれんばかりの興奮性の接続の開発を最小限に抑えます。我々は赤外線照明（IR -）と電流または電圧クランプの全細胞パッチクランプと微分干渉顕微鏡（DIC）を使用して、レイヤーII / IIIまたはVで視覚的に識別された錐体ニューロンから記録。野生型または変異カリウムチャネルのDNAの遺伝子銃（遺伝子銃）トランスフェクションは、その機能（1,14,15,17）を研究するためにチャネルの発現を操作するために使用されます。 GFPのcDNAをコトランスフェクションすることにより、トランスフェクションされた細胞は容易に落射蛍光顕微鏡下で識別されます。私たちは、同じスライス（1,17）から同じ層に隣接した、トランスフェクトされていないニューロンにトランスフェクトされた細胞の記録を比較する。

手続きはいずれも困難な、しかしいくつかの詳細に注目が大きく、結果を向上させることができるここでは説明しません。私たちの手では、細胞の生存率は、文化が〜P8 - P10の動物からのスライスから作られているときに最適です。スライスとスライスの培養中に半無菌状態を維持することが重要です。細菌汚染を防ぐために、我々は楽器をオートクレーブしUV光およびEtOH、フィルタソリューション、手袋を着用し、脳の除去となっスライス間の変化の手袋で外科領域を清掃してください。細菌汚染の影響は、貧しい人々の組織の生存能力と保育器を除染する必要性が含まれています。すべての脳スライスと同様に、生存性は、動物の犠牲とスライス間の時間を最小化することで改善されます。脳を配置する必要がありますし、スライシングは、切削液の氷冷スラリーに浸漬脳で行ってください。ブレードの低振幅水平振動と低速でのスライス、。

別の潜在的な問題は、インキュベーター中にスライス外に乾燥されています。関心と線条体の小片（オリエンテーションの目的のために）の皮質に制限された：乾燥は、小さいスライスを用意することで最小限に抑えることができます。大きいスライスは、インキュベーターで乾燥させる傾向があり、それが大きなスライスを使用して、安定した記録条件を得ることが難しくなります。スライスは、250から300μmの厚さにカットされます。我々はあまり乾燥に薄くスライスが（我々が250μmを好む）の結果がわかります。最先端のソリューションからのインキュベーターにスライスを転送する場合、我々は洗浄メディアにして、文化メディアの最初の、数回のスライスを洗う。膜（スライスがメッシュにアタッチできるように）への転送後に余分な水分を除去することが重要です。厚いスライス（例えば、300μm以下）の場合は、文化のメディアの一滴がスライスの上にペース（それは膜の上に座っている間に）乾燥を防ぐのに役立ちます。この手順では、スライスの上面に湿ったメディアの動きを準備して表示されます。一日おきに培養培地を交換しても、乾燥を防ぎ、生存率を促進する。