Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

Este protocolo se puede separar en dos etapas principales: (1) la disociación y Hoechst 33342 tinción de células de los testículos de ratón seguido, si es necesario, (2) FACS clasificación de las fracciones correspondientes meiótica, incluyendo todas las etapas de la meiosis, las células germinales de espermátidas redondas. Una vez recogidos, estas poblaciones altamente enriquecido meiótica puede ser utilizado para una amplia gama de análisis. Este protocolo describe la disociación de un testículo adulto, los volúmenes se pueden adaptar en consecuencia de los menores o de los testículos adicionales.

1. La disociación testículos

1. Coloque un testículo decapsulated en un tubo de 15 ml.
2. Añadir 3 ml de solución salina equilibrada de Gey (GBSS), que contiene 120 U / ml de colagenasa tipo I.
3. Añadir 10 l de DNasa I (1mg/ml solución de valores en el 50% de glicerol) y agitar enérgicamente a mano hasta que vea los túbulos testiculares comienzan a disociarse.
4. Agitar horizontalmente a un máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 ° C.
5. Se decanta por 1 min vertical a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
6. Repita los pasos 1,2 a 1,5.
7. Añadir 2,5 ml de GBSS contiene colagenasa tipo I, 50 l de una solución de reserva 50mg/ml tripsina resuspendido en solución de HCl 1 mM, y 10 l de DNasa I (1mg/ml), e invertir el tubo varias veces.
8. Agitar horizontalmente a un máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 ° C.
9. Utilizando una pipeta Pasteur de plástico desechables, con orificio de ancho, pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo por 3 grupos min.No debe ser visible en este momento.
10. Añadir 30 l de tripsina, 10 l de DNAsa I, 40 l de Hoechst 33342 resuspendieron en DMSO (10 mg / ml), e invertir el tubo varias veces.
11. Agitar horizontalmente a un máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 ° C.
12. Añadir 400 l de suero fetal bovino (FCS) y mezclar invirtiendo para inactivar la tripsina.
13. Tinción final se realiza mediante la adición de 50 l de Hoechst 33342 resuspendieron en DMSO (10 mg / ml), y 10 l de DNasa I (1 mg / ml).
14. Agitar horizontalmente a un máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 ° C.
15. La muestra de testículo disociada se pasa a través de dos GBSS de 40 micras previamente mojado filtros desechables en un tubo cónico de 50 ml, 5 l de yoduro de propidio (PI) y la solución se añade la muestra se mezcla suavemente con la pipeta varias veces con desechables Pasteur pipeta.
16. Muestra es transferida a una jeringa de plástico de 5 ml a través de una aguja de calibre 18. Este último es sustituido por una aguja de calibre 22 para la entrega de la muestra. La jeringa se almacena en hielo y protegido de la luz hasta que esté listo para el procesamiento de FACS.

2. FACS configuración y purificación

1. Clasificación se realizó en un clasificador de Becton-Dickinson Aria celular IIU. Las condiciones descritas por lo tanto, se debe utilizar como punto de partida, especialmente cuando se utilizan equipos diferentes. Hemos utilizado las condiciones anteriormente descritas ^7,8.
2. Dado que la IIU Aria no tiene un láser UV, adaptamos el protocolo para la detección de manchas Hoescht uso de un láser violeta de 405 nm, además de que utiliza un láser azul 488 nm para la detección de dispersión frontal y lateral. Además, algunos filtros se modificaron con el fin de limitar algunos filtración de láser rojo que resulta en la nitidez mejorada trama dispersa.
3. El láser violeta se ha configurado con un pase de banda 450/40nm para la detección de Hoescht azul de emisión y un pase de banda 585/42nm de Hoescht emisión roja. Un pase largo 502nm se utiliza para separar azul de fluorescencia de color rojo.
4. Una boquilla de 100 micras se utilizan con una frecuencia de caída de la unidad de 28.000 gotas / segundo. La tasa de umbral de la muestra fue de aproximadamente 4.000 eventos / segundo. La opción de control de la temperatura se utiliza para mantener la muestra y los tubos de recogida a 4 ° C toda la duración de la clasificación. Además, la función de la agitación de la muestra se utilizó a 200 rpm para evitar que la muestra de la sedimentación a lo largo de la clase.
5. Por lo general, dos o tres testículos fueron procesados ​​por 6 horas clase que permite la obtención de 0,5-2.0x10 ⁶ células de cada población (véase la sección representativa).
6. La muestra fue ordenada en partes alícuotas de aproximadamente 750μl dispensado desde la jeringa. Mientras tanto, durante estas pausas los tubos de recolección se mantuvieron a 4 ° C, protegido de la luz, y se mezclan suavemente antes de ordenar la reanudación.
7. Las muestras fueron ordenados en un tubo de recogida de vidrio borosilicatado 12x75mm contiene 250μl DMEM suplementado con 10% FCS.

3. Los resultados representativos:

Un típico perfil de FACS se muestra en la Figura 1. Todos los pasos más importantes de la meiosis se identifican y se indican en la leyenda. Si el Hoechst 33342 tinción no es óptimo, el perfil global parece mucho más compacto y menos definida. Un problema común se refiere a que no agrega suficiente DNAsa, lo que induce aglutinación rápida de las células. Además de DNAsa adicional en todos los pasos procesados ​​por lo general resuelve este problema. Congelar ªintimidar las acciones de DNAsa (almacenadas a -20 ° C) debe ser reducido al mínimo, ya que esto da lugar a una rápida pérdida de actividad de la enzima.

Spo11 es la endonucleasa meiótica que dirige la doble cadena se rompe en los sitios de sitios de recombinación meiótica ^12. La figura 2 muestra los perfiles típicos de un testículo Spo11 nulo en doble capítulo romper no se forman, lo que resulta en una meiosis abortiva ^12, así como una pre-puberous perfil de un ratón de 13 días de edad, lo que revela la naturaleza asíncrona de esta primera ola de la meiosis. Estándar de análisis citogenético mediante la combinación de proteínas complejas sinaptonémico 3 (SCP3) y fosforilados anticuerpos histona H2AX etapa de marcadores específicos de la meiosis debe ser utilizado inicialmente para confirmar la pureza y la naturaleza de las células meióticas ordenados, como se describe elswhere ^11.

Figura 1. Tipo salvaje FACS meiosis perfiles. A) diagrama de dispersión se muestra Representante. Las células cerradas se muestran. Tenga en cuenta la gran cantidad de residuos presentes en los testículos adultos que contienen principalmente las membranas vacías y las colas de espermatozoides. B) Un representante parcela PI muestra la cantidad muy limitada de células PI positivas presentes en una muestra. La puerta típica se muestra. C) Un representante de tipo salvaje Hoechst 33342 se muestra el perfil de FACS. Las distintas poblaciones de células meióticas que puede ser purificado mediante este método para el estudio adicional se indican: espermatogonias (E), pre-leptotene (PL), leptotene-zygotene (L / Z), a principios de Paquiteno (PE), el medio Paquiteno ( MP), de finales del Paquiteno (LP), diplotene (D), y espermátidas redondas (RS).

Figura 2. Spo11 nulo y de tipo salvaje día 13 perfiles FACS meióticas. A) Una típica Spo11 nulo perfil se muestra con un claro fracaso meiótica, donde puede haber más allá de la etapa leptotene / zygotene temprana pachytene detectado. B) El perfil de una de 13 días de edad, de tipo salvaje ratones machos se muestra la alta concentración de células leptotene / zygotene. Esta primera oleada de la meiosis es bastante asíncrono, como claramente se visualizan mediante esta metodología.

El protocolo presentado en este documento permite purificar al mismo tiempo de ratones machos adultos de toda la gama de las células del estadio meiótico con una pureza muy alta, permitiendo a los investigadores estudiar la dinámica de este proceso fundamental. Células purificadas se pueden utilizar para numerosas aplicaciones que van desde la extracción de RNA ^9,10, la cartografía nucleosoma ^11, la detección de moléculas recombinantes, análisis de proteína, y muchos más. Sin embargo, los métodos de detección tienen que ser adaptados a la cantidad de células meióticas purificada. Además, con la alta reproducibilidad de este método, es posible agrupar varias clases independientes de la misma fracción realizadas en días diferentes para aumentar la cantidad de material necesario para un experimento particular. Además, este método proporciona a los investigadores con una única representación visual del proceso meiótico completo, que permite evaluar rápidamente los efectos de los octavos de final genética, aberración progreso en el desarrollo, o el efecto de un tratamiento en particular destinado a atentar contra la meiosis (por ejemplo, la irradiación, o tratamiento con inhibidores de molécula pequeña).

Los pasos críticos de este protocolo son: (i) el uso de DNAsa suficiente, lo que facilita la clasificación de células, evitando acumulaciones de células y agregados, y (ii) consistentes Hoechst 33342 tinción que es necesario distinguir de manera eficiente las distintas poblaciones de células estadio meiótico. Además, el operador de FACS deben familiarizarse con las características y peculiaridades de la selección de células meióticas en el fin de configurar de forma óptima su instrumento para obtener los perfiles mostrados en la Figura 1, así como en el video. Una posible modificación podría ser la de sustituir el Hoechst 33342 con la nueva Violeta Vybrant DyeCycle Stain (Invitrogen) que ha sido optimizado para que el láser violeta. Sin embargo, el perfil general no se espera que cambie drásticamente. Por último, también es importante señalar que debido a la naturaleza de los tejidos utilizados, un procedimiento típico le da 1 ½ hora de preparar las células meióticas y de 4 a 6 horas para el tipo de células, además de las manipulaciones adicionales tipo post-.