Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

1. Coleta de rato Pele Limb embrionárias (E13.5 E17.5 ~)

1. Euthanize conectado fêmeas através de um procedimento aprovado. De acordo com nosso protocolo aprovado animais, as fêmeas são sacrificados por exposição ao CO ₂ e, em seguida, assegurada por deslocamento cervical. Lay o animal à sua toalha de papel absorvente e deixe-o completamente em 70% EtOH / H ₂ O de uma garrafa squeeze.
2. Dissecar o útero intacto e coloque-o em um prato 100 15 mm x Petri contendo solução gelada de Hanks salina balanceada (HBSS) para lavar o sangue.
3. Separado e dissecar o embrião. Remover o âmnio muito fina a partir do embrião.
4. (Opção) Dissecar um único embrião em um 35 10 mm x placa de Petri se cada embrião deve ser genotipados. Dissecados cauda é transferido para um tubo de 0,2 ml PCR para genotipagem.
5. Cortar as patas dianteiras do embrião e transferência forelimbs por uma pinça de anel em 24 placa bem contendo 2 ml de gelado paraformaldeído frescos 4% (PFA) em tampão fosfato salino (PBS).
6. Corrigir o forelimbs com suave mistura na Mixer Nutator a 4 ° C durante a noite.
7. No dia seguinte, retire a PFA e lavar três vezes por 5 min em 2 ml de PBS com leve mistura no Mixer Nutator à temperatura ambiente.
8. Transferir os membros anteriores em metanol 100% (MeOH) e armazená-los freezer a -20 ° C enzima (o freezer com controle de temperatura crítica e sem função de descongelação automática). Anticorpos primárias constantes da Tabela 1 trabalho após o tratamento MeOH 100%.
9. Peeling off do membro anterior, usando uma pinça fina. Pele dos membros, quando desidratado, deve separar facilmente a partir do membro. Primeiro lugar o membro com o lado ventral (lado da palma) voltado para cima. Em seguida, usando uma pinça fina, cortar a pele, como mostrado no vídeo. Próxima dissecar todo o membro inteiro, descascando a pele suavemente, sem qualquer dano.

2. Toda montagem de coloração imuno-histoquímica de Skins Limb

1. Hidratar as peles de membros em 5ml de polipropileno tubos de fundo redondo, incubando através da série graduada de MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) por 5 min cada. Note-se que a troca de soluções deve ser cuidadoso para não danificar as peles dos membros.
2. Lavar duas vezes por 5 min em PBT com suave mistura na Mixer Nutator à temperatura ambiente.
3. Bloquear o membro com peles de cabra ou 10% de soro / PBS 0,2% TX100 tampão de bloqueio por anticorpos de cabra secundário ou 10% Donkey soro / PBS 0,2% TX100 tampão de bloqueio por anticorpos burro secundário por 2 horas com a mistura suave no Mixer Nutator em temperatura ambiente.
4. Coloque as cascas dos membros em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em microcentrífuga-2ml tubo com 800μl de anticorpos primários (diluição adequada, conforme listado nas tabelas) no tampão de bloqueio (ou 10% de soro de cabra / PBS 0,2 TX100% ou 10% Donkey soro / PBS 0,2% TX100). Incubar as peles membro com suave mistura na Mixer Nutator a 4 ° C durante a noite. Note-se que vários anticorpos primários derivados de espécies diferentes (por exemplo, anticorpo monoclonal de rato + anticorpo policlonal de coelho) podem ser usados ​​simultaneamente.
5. No dia seguinte, coloque as peles do membro em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em polipropileno 5ml de fundo redondo de tubo com 4ml da solução de lavagem (ou 2% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 2 TX100 Donkey% de soro / PBS 0,2% TX100).
6. Lavar cinco vezes por 15 minutos com a mistura suave no Mixer Nutator à temperatura ambiente.
7. Coloque as cascas dos membros em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em microcentrífuga-2ml tubo com 800μl de anticorpos secundária no tampão de bloqueio (ou 10% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 10% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100). Normalmente usamos anticorpos secundários a partir de Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 diluições) ou Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 diluição). Filtrar a solução usando anticorpo secundário 0.22μm PVDF filtros de membrana seringa para remover as partículas agregadas dos anticorpos secundários. Incubar as peles dos membros no escuro ou envolto com papel alumínio por 1 hora com a mistura suave na Mixer Nutator à temperatura ambiente. Note-se que diferentes fluorescentes conjugados anticorpos secundários derivados de espécies diferentes podem ser usados ​​simultaneamente.
8. Coloque as cascas dos membros em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em 5ml de polipropileno tubos de fundo redondo com 4ml da solução de lavagem (ou 2% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 2% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100). Lavar cinco vezes por 15 min no escuro ou envolto com folha de alumínio com a mistura suave no Mixer Nutator à temperatura ambiente.
9. (Opção para contracoloração contra núcleo) Incubar as peles membro com 4ml da solução de lavagem (ou cabra 2% de soro / PBS 0,2% ou 2% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100) com To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 diluição) no escuro ou envolto com papel alumínio por 10 minutos com a mistura suave no Mixer Nutator na sala de temperature. Então, lave três vezes por 5 min com 4ml da solução de lavagem (ou 2% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 2% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100) no escuro ou envolto por folhas de alumínio com a mistura suave no o Mixer Nutator à temperatura ambiente. Note-se que a coloração forte e específica para núcleos é observado para To-pro-3 em uma emissão específica (HeNe excitação nm 633).

3. Montagem do Skins Limb no slide

1. Coloque as cascas em um membro 35 10 mm x placa de Petri. Remover poeiras, cristais, fibras da camada interna da pele, usando uma pinça fina sob o estereomicroscópio com iluminação baixa para evitar a foto branqueamento extensivo.
2. Transferir os skins membro para lâmina de microscópio adesiva por uma pinça de anel. Coloque as peles com a camada interna deitada para cima no slide (ou seja, para lamela). Achate as peles cuidadosamente usando uma pinça fina e remover carry-over tampão de lavagem por Kimwipe.
3. Montagem em anti-fade meios de montagem sem bolhas de ar. Nós usamos 25 "x25" lamela. Cura em uma superfície plana no escuro (por exemplo, as amostras montado usando Prolongar reagente de ouro são colocadas durante a noite no escuro à temperatura ambiente antes de visualizar). Para armazenamento a longo prazo, vedar a lamela para o slide e armazenar a 4 ° C.

4. Microscopia confocal

1. Criar lasers apropriados para fluoróforos. Usamos Leica TCS microscópio confocal SP5 com três fontes de laser de argônio, incluindo 488nm (para Alexa Fluor 488 e GFP), 561nm DPSS (por Alexa Fluor 568 e Cy3) e 633 nm HeNe (por Alexa Fluor 633, Cy5 e Para-Pro-3) .
2. Use a ferramenta de busca sequencial para evitar ou reduzir a interferência em que todos os corantes em amostras de dobrar ou triplicar manchada será animado ao mesmo tempo. No modo de varredura seqüencial, as imagens serão gravadas em uma ordem seqüencial.
3. Mais informações gerais sobre corantes fluorescentes e lasers para a excitação pode ser fundada em "Microscopia Confocal para biólogos" por Hibbs (2004)

5. Resultados representante

Todo-mount microscopia confocal triple-label immnofluorescence em pele de rato forelimb em E15.5 com anticorpos para o marcador de células pan-endotelial PECAM-1 (Figura 1A-C, D azul), o marcador neurofilamento 2H3 (Figura 1A verde), e o marcador de células musculares lisas αSMA (Figura 1A, B vermelho) revelou um padrão característico de ramificação das artérias αSMA ^+, alinhado com 2H3 ⁺ nervos periféricos na pele dos membros. Além de ramificação dos vasos sanguíneos, este membro modelo vascularização da pele é usada para estudar padrões de ramificação de vasos linfáticos utilizando anticorpos para o marcador de células endoteliais linfáticas lyve-1 (Figura 1D, E vermelha) e Neuropilin2 (NRP2) (Figura 1D, F verde ).

Figura 1. (AC) Artérias alinhar com os nervos periféricos na pele dos membros embrionárias. Todo-mount-label triple microscopia confocal immnofluorescence com anticorpos para o marcador de células pan-endotelial PECAM-1 (AC, azul), o marcador neurofilamento 2H3 (A, verde), eo marcador de células musculares lisas αSMA (A e B, vermelho ) é mostrado. No E15.5, 2H3 ⁺ nervos periféricos (setas abertas) associado com artérias (setas), que são cobertos por αSMA ⁺ células musculares lisas. (DF) vasculatura linfática na pele dos membros embrionárias. Label triple-microscopia confocal immnofluorescence com anticorpos para o marcador de células pan-endotelial PECAM-1 (D, azul), o marcador de células endoteliais linfáticas lyve-1 (D e E, vermelho) e Neuropilin2 (NRP2) (D e F, verde ) é mostrado. Vasos linfáticos são visualizados por ambos lyve-1 e NRP2, enquanto lyve-1 também é expressa por um subconjunto de macrófagos (setas abertas). Barra de escala: 100μm.

O sistema vascular é fundamental para o desenvolvimento do órgão durante a embriogênese, bem como para a manutenção de órgãos e funções reprodutivas nos adultos, pois fornece oxigênio e nutrientes suficientes para os órgãos. Rede vascular adequada é bem estabelecido com processos complexos e multi-passo a angiogênese em que o pré-existentes da rede capilar é reorganizada com estruturas altamente ramificada e hierarquizada. Apesar de inúmeros trabalhos têm demonstrado que uma variedade de moléculas está envolvida nestes processos, não ficou claro como os órgãos ou seus componentes fornecem os sinais para promover o processo gradual do desenvolvimento vascular incluindo diferenciação endotelial vascular e padronização de ramificação. Para abordar esta questão, os órgãos apropriados vascularizado, onde somos capazes de acompanhar o processo de desenvolvimento vascular são obrigatórios. O membro modelo vasculatura da pele com ganho de função e perda de função manipulações genéticas de alta resolução permite a análise do desenvolvimento vascular.

Descrevemos aqui um protocolo detalhado, incluindo a dissecção da forelimbs embrionárias de camundongos, todo-mount coloração imuno-histoquímica e microscopia confocal, que é utilizada rotineiramente em nosso laboratório para analisar a angiogênese membro da pele e linfangiogênese. O protocolo fornece resultados reprodutíveis e vascularização intacta para o início, bem como da pele do membro final embrionárias é facilmente visualizados por microscopia confocal. É também aplicável para o adulto ouvido pele vasculatura (YM e K. Perkins, não publicado). Para explorar ainda mais a imagem da dinâmica de crescimento dos vasos sanguíneos e remodelação, no entanto, o modelo de outros animais, como peixe-zebra com os vasos sanguíneos fluorescente etiquetado é útil para time-lapse imagem da vasculatura in vivo com alta resolução.

Todo-mount microscopia confocal com rotulagem múltiplos marcadores vasculares nos permitiu sangue de imagem e células endoteliais linfáticas e seus vizinhos, incluindo células musculares lisas e pericitos nas peles. Além dos anticorpos marcador vascular (Tabela 2), anticorpos para os produtos repórter gene (β-galactosidase, β-gal e proteína fluorescente verde, GFP, Tabela 2) que recapitulam o padrão de expressão de genes endógenos de seu interesse pode ser usado. Por exemplo, usamos forelimb pele de embriões portadores de repórter lacZ direcionados ao ephrinB2 (Wang et al., 1998) ou locus EphB4 (Gerety et al., 1999), que fornece um indicador histoquímica de ephrinB2 ou EphB4. EphrinB2, um ligante transmembrana, é expressa por artérias, mas não as veias, ao passo que seu receptor, o EphB4 tirosina quinase é preferencialmente expresso por veias (Wang et al., 1998). Todo-mount análise imunohistoquímica em peles de forelimb E15.5 ephrinB2 ^{lacZ / +} ou EphB4 ^{lacZ /} embriões ⁺ heterozigoto revelou que nervos sensoriais periféricos associados preferencialmente com vasos arteriais (Mukouyama et al. 2002). Estes ratos estão disponíveis no Laboratório Jackson (Efnb2 ^tm1And / J: stock # 006039, Ephb4 ^tm1And / J: stock # 006044).

O estudo das diferentes fases destes sistemas vascular revela a dinâmica celular da angiogênese vascular, incluindo a ramificação arterial / venoso diferenciação, o desenvolvimento de vasos linfáticos e cobertura muscular / pericyte suave na pele de membros em desenvolvimento. Por E13.5, primitivo plexo capilar foi estabelecido na pele dos membros, mas nenhuma associação entre os nervos sensoriais e os vasos sanguíneos foi observada. Por E14.5, vascular e remodelação ocorreu nervosos associados com remodelada vasos ramificados, que expressam marcadores de células endoteliais arteriais e têm αSMA ⁺ células musculares lisas (Mukouyama et al. 2002). Estudos genéticos sugerem que os nervos sensoriais periféricos fornecer um modelo para determinação dos padrões de ramificação dos vasos sanguíneos e diferenciação arterial (Mukouyama et al. 2002). A análise do nervo-VEGF-A mutantes condicionais revelou que o nervo derivados VEGF-A é necessário para a diferenciação arterial no membro pele vasculatura (Mukouyama et al. 2005). Nossos resultados também mostraram que o nervo VEGF-A mutantes condicionais apresentam menor comprometimento do nervo navio-alinhamento, indicando o envolvimento do fator angiogênico adicional (s). Isto sugere que o membro modelo vasculatura da pele nos permite estudar diferentes mecanismos que controlam a diferenciação arterial e padronização de ramificação vascular. Além disso, o que controla a diferenciação venosa e padronização de venoso e linfático navio ramificação ainda precisa ser respondida.