ビボ犬筋肉の機能アッセイに

Childers, M. K., Grange, R. W., Kornegay, J. N. In Vivo Canine Muscle Function Assay. J. Vis. Exp. (50), e2623, doi:10.3791/2623 (2011).

私たちは、犬の骨盤下肢筋力と繰り返しエキセントリック収縮への筋肉の反応を測定するための低侵襲性と再現方法を説明します。麻酔犬の骨盤の肢は大腿骨に対して直角に脛骨を整列させる定位フレームに固定化されている。接着剤のラップは、トルクを測定するためにサーボモータのシャフトに取り付けられたペダルに足を押さなけれ。経皮的神経刺激は、等尺性トルクを生成するためにペダルに対してどちらかのプッシュ（拡張）またはプル（フレックス）に足の骨盤四肢の筋肉を活性化する。経皮的脛骨神経刺激は、tibiotarsa​​l伸筋を活性化する。繰り返し偏心（延長）の収縮は、経皮的腓骨神経の刺激によってtibiotarsa​​l屈筋に誘導されています。偏心プロトコルは、サーボモータによって課される強制ストレッチに続いて最初の等尺性収縮で構成されています。それが契約、例えば、 伸張性収縮をしながら回転を効果的に筋肉が長くなります。刺激時の屈筋は800ミリ秒アイソメトリックと200ミリ秒エキセントリック収縮に供される。この手順は、毎5秒に繰り返されます。疲労を避けるために、4分の残りは実行される30の収縮の合計で、10の収縮に従います。

1。実験のための設定

1. ダイナミックマッスルコントロール（DMC）のソフトウェアをロードします。
2. メーカーの指示に従って、生理学のリグの電源を入れます。
3. DMCのソフトウェアを実行している。

それは、ハードウェアがDMCソフトウェアを実行するコンピュータに接続されていると仮定され、そしてシステムが校正されている。ソフトウェアは、随時改定されることがありますので、指示には以下の我々が使用している現在のソフトウェアバージョンに関連して提供されています。ソフトウェアが開かれると、それはすでに実行されています。

ユーザーが最初にDMCのプロトコル（例えば、等尺性破傷風を生成するために1.5秒、50 Hzで刺激する）およびプロトコルを記述することができますし、その後の使用のために保存することができます。 、及び（2） 偏心ストレッチ傷害のプロトコル （1） 等尺性収縮のプロトコル （例えば、単収縮または破傷風）：我々は2つの標準プロトコルを使用してください。私たちは、けいれんのための等尺性収縮のプロトコルで始まります。けいれんを最適化するには、モニター出力の画面が使用され、電極が移動される単収縮時に発生するトルクを観察することができます。最大収縮応答が達成されると、データがメイン画面（Continueを選択）に戻ると、 開始と完了を選択して収集されます。ファイルは、ポップアップウィンドウとして保存で保存されます。同じ位置で維持電極と、破傷風（50 Hz）はその後回収され、保存されます。すべての等尺性収縮が完了すると、偏心ストレッチ傷害のプロトコルをロードして実行することができます。このプロトコルで実行されるように収縮（10収縮）のシリーズがあるため、メイン画面にファイル名を指定して実行ボタンは1つのすべての状態を実行明らかにするために選択されています。今すぐ始めるが選択されている場合、 すべてのプロトコルは、ウィンドウをポップアップするファイル名を指定して実行にはルートファイル名とファイルが保存先となるディレクトリの入力を求める表示されます。次に、 プロトコルのシリーズテストを開始し、 完了偏心プロトコルを開始するために選択されています。ファイルが選択したディレクトリに自動的に保存されます。

2。生理学リグで動物の配​​置

1. 動物のケアと使用委員会（ACUC）ガイドラインは、動物を含むすべての処理に従わなければなりません。
2. 承認されたプロトコールに従って（例えばイソフルランなど）吸入麻酔を使用して犬を麻酔。動物が深く麻酔であることを確認するために反射点滅を確認してください。 CO ₂モニタリング、パルスオキシメータと温度が密接に全体の手順の実行中に監視する必要があります。我々は通常、吸入麻酔のためのセボフルランが続く誘導のためにプロポフォールを使用してください。
3. （すなわち、大転子から遠位の2〜3センチメートルに腓骨頭での四肢の初めの外側面刺激電極が配置される場所（ひざ）抑圧横方向の周りの毛を剃る。
4. 大腿骨と脛骨が直角を作るように配置骨盤四肢、および脛骨と背側横臥位で生理のテーブルの上に位置する犬は、卓上に平行である。右または左の手足を試験することができるのどちらか。
5. ペダルを強制的に犬の足を取り付ける前に、力のペダルが回転するように明確で安全であることを保証するために確認してください。生理学のリグのための手続きに電源を入れるとペダルをアクティブに従ってください。注：ユーザーが手動でそれを移動しようとしたときの力のペダルは"硬い"でなければならない。
6. ゆっくりとフットペダルでの犬の足安心、測定をし、回転の中心軸からの横の数字の末尾に犬の足の長さを記録。
7. 弾性自己付着ラップを使用して、フットペダルに足を固定します。

3。等尺性単収縮トルク（tibiotarsa​​l屈曲）

1. 安全性チェックに続いて、刺激分離ユニット（SIU）に無菌のシールドモノポーラ24番ゲージの刺激電極を接続してください。
2. に刺激を設定：連続的なパルス出力は1Hz（1秒間に1パルス）で
3. ソフトウェアの設定： 等尺性収縮のプロトコルを （メイン画面を選択負荷プロトコル上で）ロードしてください。 ランワンボタンで開始ボタンの横に表示されるはずです。これは、プロトコルは一度だけ実行されることが保証されます。
4. 手袋をはめた手で、アルコールで皮膚をきれいに、そして外側近位腓骨のすぐ遠位総腓骨神経を触診する。神経の領域をマーキング指で、慎重に皮膚の下にカソード（黒）電極を挿入し、骨膜に外付けするだけ。電極は、約2cmの深さで皮膚の表面に平行に手が削除されたときに移動するから電極を防ぐのに十分に配置する必要があります。
5. パラレルおよびカソード電極に少し遠位、皮膚の下にアノード（赤）電極を置きます。両電極は、今腓骨頭にちょうど遠位総腓骨神経の内部でなければなりません。
6. stimulaを活性化する1 HzでのTor。モニター上の単収縮反応を観察します。可能な最大の単収縮の振幅を得るために電極位置の微調整を行います。電極は完全に最大の攣縮反応を見つけるために脛骨に平行三から四½ cmの単位で削除し、交換する必要があります。これは、手順の重要なコンポーネントであり、最大の応答を見つけるために細心の注意が払われている必要があります。
7. モニター出力の画面を（Continueを選択）終了することにより、単収縮の応答を記録し、[ 開始 ]を選択し、データを収集するために行われた。ポップアップウィンドウで[名前を付けて保存]で目的のファイル名でファイルを保存します。刺激装置の電源を切ります。

4。等尺性テタニーのトルク（tibiotarsa​​l屈曲）

1. 電極を移動せずに、1.5秒の場合は50 Hzに刺激の設定を変更し、外部トリガ機能を有効にしてください。これは、刺激がソフトウエアによって活性化することができます。
2. ソフトウェアの設定：同じ等尺性収縮のプロトコルは、筋の場合と破傷風の応答を収集するために使用されます。刺激電極始める 、移動と完了されていないと仮定すると、破傷風を生成するように選択されています。破傷風を生産する等尺性プロトコルでは、刺激が正しいタイミングを維持するためにソフトウェアによってトリガされます。ポップアップウィンドウで[名前を付けて保存]で破傷風の応答を保存します。

5。偏心プロトコル

1. 1秒（100V）のための50ヘルツを、外部トリガ機能を有効にする：電極を移動せずに、に刺激の設定を変更してください。これは、刺激がソフトウエアによって活性化することができます。
2. ソフトウェアの設定： 偏心ストレッチ傷害のプロトコル 、29度（30度が最大となる）を回転させるサーボモータにコマンドを読み込みます。 すべての実行]を選択します。 開始を選択し、それらが保存先となるファイルの偏心一連のルートファイル名とフォルダを入力します。 プロトコールシリーズの[Start Test]を選択し、[プロトコルを開始するために完了 。
3. このプロトコルでは刺激が正しいタイミングを維持するためにソフトウェアによってトリガされるように設定されています。各偏心収縮に対する応答が画面に表示されるとおり、それは自動的に保存されます。
4. 4分の残りの期間は、10エキセントリック収縮の各セットに従います。
5. 30偏心収縮（; 4分の残りの期間で区切られた各セットten収縮の3つのセット）の合計を収集する。

6。等尺性単収縮トルク（tibiotarsa​​l拡張子）

1. 上記の単収縮のプロトコルを繰り返しますが、電極が皮膚や屈曲のプロトコルのための独自の電極配置に近位に垂直に置きます。脛骨神経が刺激されるgastrocnemious筋肉の腹内尾側と遠位に、それはコースのよう。ペア刺激と参照電極は、尾と圧殺するためにちょうど近位筋の奥深くに配置されます。配置のおおよそのポイントは、（膝）抑圧によって形成された90度の角度を二等分する線に沿っている。脛骨神経は総腓骨神経に（と尾）深くにあるので、電極は、最適な筋電位を引き出すために、いくつかの領域に配置する必要があります。これは、手順の重要なコンポーネントです。注：tibiotarsa​​lけいれんとテタニーのためのトルクの追跡機能がtibiotarsa​​l屈曲の追跡機能に対して反転されて表示されます。

7。等尺性テタニーのトルク（tibiotarsa​​l拡張子）

1. 電極を移動せずに、1.5秒の場合は50 Hzに刺激の設定を変更し、外部トリガ機能を有効にしてください。これは、刺激がソフトウエアによって活性化することができます。
2. ソフトウェアの設定への：50 1.5秒Hzおよび外部トリガ機能を有効にする。これは、刺激がソフトウエアによって活性化することができます。
3. ソフトウェアの設定： 同じ等尺性収縮のプロトコルは、筋の場合と破傷風のために使用されます。刺激電極始める 、移動と完了されていないと仮定すると、破傷風を生成するように選択されています。
4. 破傷風を生産する等尺性プロトコルでは、刺激が正しいタイミングを維持するためにソフトウェアによってトリガされます。ポップで強直性応答までのファイルのウィンドウを保存を保存します。

8。データの分析

1. 動的な筋肉の分析（DMA）プログラム（オーロラ科学）はトルクと痙攣、テタニーや偏心収縮から収集された時間情報を取得するために使用されます。
2. DMAのプログラムの実行：ソフトウェアは、随時改定されることがありますので、指示は私たちが使用する現在のソフトウェアバージョンに関連する以下に用意されています。 DMAのソフトウェアは、それが実行されていない開かれている場合。プログラムを有効にするには、左上隅にある白い矢印のボタンを選択します。 DMAのソフトウェアは多数の機能を持っていますが、私たちの目的のためにsは、わずか数関連機能について説明する。
   分析するファイルをロードします。？リロード最近のデータファイルまたは新しいデータファイルには、DMAのプログラムの起動時にウィンドウが表示されるポップアップ。 [新規作成]を選択します。次のウィンドウを選択し、LabVIEWで、次のウィンドウで、適切なフォルダとファイルを選択し、[開く]を選択します。このウィンドウを削除するフィルタのプロットを削除]を選択します。 カットオフ周波数のボックスでフィルタ周波数を入力してください。最適なフィルター周波数が評価される特定のデータに基づいて決定されなければならない。例として、私たちは等尺性応答および偏心応答のための10 Hzのを30 Hzを使用してください。 使用してフィルタリングされたデータのボタンを選択します。 選択プロットデータの下に、 フィルタを強制]を選択します。表示を展開し、ファイルを移動するには下部にある2つのスライドバーを使用してください。
3. 単収縮の解析（ 図1）：ファイルがロードされ、上記の手順が完了すると仮定すると、カーソルの位置を設定：3カーソルがある：（1）青は、（2）黄色（3）白。等尺性けいれんや破傷風菌や他の等尺性収縮の場合は、青色はトルクが安静時のトルクから上昇していく点に設定され、トルクが安静時のトルクに戻ったところ、黄色が配置されている（すなわち、弛緩期後）、白はに配置されます黄色のカーソルの右側（不要）。カーソルは、簡単にマウスで押されて、その目的の位置に選択したカーソルをドラッグして左ボタンで移動されます。
   分析を実行する：カーソルが配置されている場合は、Do筋肉の分析を選択し、[ 結果]を表示します 。ポップアップウィンドウで分析された筋肉のデータの結果で、変数の数がそのような力の最大値として表示され、 ベースラインフォース、½緩和時間などのデータはカーソル1（青）と2（黄色の間にあるトルク応答のために提示されています）。これらの変数または特定の変数のすべてをデータファイルに記録することができますが、そのプロセスはここに記載されていません。データのログが設定されていない場合、データは手で記録する必要があります。メイン画面に戻るにはウィンドウを閉じる]を選択します。 DMAを閉じるには、 出口プログラムを選択し、[新しいファイルの分析を開始するために白い矢印を選択します。
4. テタニーの分析（ 図2）：筋について上述したのと同じ手順。
5. 偏心解析（ 図3）：偏心分析は、設定するために多くのステップを必要とし、全3カーソルを使用しています。偏心トルク応答が負である（すなわち、トルクの追跡機能は、下方向に表示される）、それがリファレンスエリアで-1入力することによって反転することができる場合（平方センチ）ボックス（トルクの値が変更されていない）とselect 正規化しないでください 。ボタンは、データが（この場合は、反転）正規化されていることを示すために反転させます。 オフ周波数は 、目的のカット （例えば、10Hz）を入力し、 フィルタされたデータを使用するためのボタンを逆にフィルタリングされていないデータを使用する]を選択し 、現在はフィルタリングされたデータは分析のために使用されます。トルクはに戻った白のカーソルを位置、等尺性トルクが休息トルクから上昇し始める時点で青いカーソルを置き、偏心ストレッチトルクが等角投影高原から上昇し始める時点でポジション黄色のカーソルを（下図参照）トルクを休憩。 筋肉の分析をしない]を選択、[ 結果]を表示します 。ポップアップウィンドウが分析された筋肉のデータの結果では、等尺性トルクのデータのためのカーソル1（青）と2（黄）との間でデータを選択することができる、または偏心トルクのデータのためのカーソル2（黄）と3（白）の間。これらの変数または特定の変数のすべてをデータファイルに記録することができますが、そのプロセスはここに記載されていません。データのログが設定されていない場合、データは手で記録する必要があります。メイン画面に戻るにはウィンドウを閉じる]を選択します。 DMAを閉じるには、 出口プログラムを選択し、[新しいファイルの分析を開始するために白い矢印を選択します。

9。代表的な結果

1. トルクをけいれんさせる：脛骨神経刺激（1Hz）でtibiotarsal伸筋の活性化、単一の攣縮（ 図1）。トルク（力と距離の積）がユーザによって算出され、Y軸は"力"を示すことに注意してください。我々は、（回転軸からの横の数字の末尾に）足の長さを測定する。この長さは、トルク（Nm）を決定するために使用される距離（レバーアーム）です。
2. 等尺性テタニーのトルク（tibiotarsa​​l拡張子）：脛骨神経の刺激はtibiotarsa​​l伸筋を（50Hzのパルスの1.5秒の電車）tetanized。我々は、刺激のタイミングを制御し、トルクの応答（ 図2）をキャプチャする（DMC、オーロラ科学社）ダイナミック筋肉のコントロールのコンピュータソフトウェアを使用する。
3. エキセントリックプロトコル：エキセントリック収縮がtibiotarsa​​l屈筋で実施された。経皮的腓骨神経stimulエーションは、活性化屈筋（エキセントリック収縮、 図3）の延長を引き起こす関節の回転に続いて最初の等尺性収縮を活性化^。6

図1。青（＃1）、黄色（＃2）と白（＃3）カーソルの配置が攣縮を分析する。 DMAのソフトウェアの代表的なスクリーンショットは、健康な13キロの犬でtibiotarsa​​l拡張のけいれんのために示されています。ソフトウェアによって実行されるその後の分析のために、データがスプレッドシート、および力の出力（フォースは（g）の力の積で計算されるトルク（Nm）。トルクに変換することができ、図中のためにエクスポートされることに注意してくださいレバーアームの距離（この距離では=長さが足の横桁に回転軸から測定）。

図2：ブルー（＃1）、黄色（＃2）と白（＃3）カーソルの配置は、破傷風を分析する。 図1に示すように、DMAのソフトウェアのショットの代表的な画面がtibiotarsal拡張テタニー、同じ動物のために示されています。

図3。青（＃1）、黄色（＃2）と白（＃3）カーソルの配置は偏心ストレッチ傷害の収縮を分析する。 DMAのソフトウェアの代表的なスクリーンショットは、健康な13キロの犬における単偏心ストレッチ傷害の収縮のために示されています。初期の高原（緑線）は収縮の等尺性相を示しています。等尺性相は緑のラインが急速にピークで示されているように偏心（ストレッチ）相が続きます。繰り返しエキセントリック収縮は通常、等尺性トルクの着実な減少につながる。

このプロトコルは、分析し文書化し、決定する治療介入の有効性をまたは疾患の進行の生物学的特徴を文書化するためにin vivoでの大規模な動物の筋肉の機能を評価するために使用されます^。1-6動物の位置、手足の配置および電極の配置は、その重大な影響を与える結果の重要な変数です。予備的研究では、イソフルランのための肺胞内濃度（MAC）の値が大幅に力の測定値（Schueler RO、コッホH、Kornegay JN、未発表データ、1993年）に影響しなかった。ハードウェアとソフトウェアが市販されていると方法が十分に確立されたことを意味^{しますが、 1,2,8,4,9-11,6,12は、}ユーザーの皆様には、このプロトコルに従うとき、上記のソフトウェアや機器を入手して使用することをお勧めします。

変更：現在のサーボモータの制限は約23キロと20cmの足の長さのボディの質量が含まれています。トルク制限、トルク変換器（モデル310LR）のための〜8 N -メーターはここで説明されていることに注意してください。この値は、6カ月以上前に正常な犬に超えている可能性があります。現在のプロトコルへの可能な変更は、ソフトウェアの更新など、トランスデューサのトルクの範囲を増加する。オーロラサイエンティフィック社は、現在のプロトコルで使用されている定位フレームの代わりに使用できる大型動物の四肢の位置決め装置を製造しています。このメソッドは、ヒト以外の霊長類を含め、他の動物モデルに正常に適用されています。

このビデオ記事の生産はオーロラサイエンティフィック社が後援した

国立衛生研究所（NIH）、ジョシュアFrase財団、筋ジストロフィー協会（MDA）。

1. Childers, M.K., Okamura, C.S., Bogan, D.J., Bogan, J.R., Petroski, G.F., McDonald, K., Kornegay, J.N. Eccentric contraction injury in dystrophic canine muscle. Arch Phys Med Rehabil 83 : 1572-1578 (2002).
2. Childers, M.K., Okamura, C.S., Bogan, D.J., Bogan, J.R., Sullivan, M.J., Kornegay, J.N. Myofiber injury and regeneration in a canine homologue of Duchenne muscular dystrophy. Am J Phys Med Rehabil 80 : 175-181 (2001).
3. Childers MK, Staley JT, Kornegay JN, McDonald KS. Skinned single fibers from normal and dystrophin-deficient dogs incur comparable stretch-induced force deficits. Muscle Nerve 31 : 768-771 (2005).
4. Kornegay, J.N., Bogan, D.J., Bogan, J.R., Childers, M.K., Cundiff, D.D., Petroski, G.F., Schueler, R.O. Contraction force generated by tarsal joint flexion and extension in dogs with golden retriever muscular dystrophy. J Neurol Sci 166 : 115-121 (1999).
5. Liu, J.M., Okamura, C.S., Bogan, D.J., Bogan, J.R., Childers, M.K., Kornegay, J.N. Effects of prednisone in canine muscular dystrophy. Muscle Nerve 30 : 767-773 (2004).
6. Tegeler, C.J., Grange, R.W., Bogan, D.J., Markert, C.D., Case, D., Kornegay, J.N., Childers, M.K. Eccentric contractions induce rapid isometric torque drop in dystrophin-deficient dogs. Muscle Nerve 42 : 130-132 (2010).
7. Allen, D.G. Eccentric muscle damage: mechanisms of early reduction of force. Acta Physiol Scand 171 : 311-319 (2001).
8. Friden, J., Lieber, R.L. Eccentric exercise-induced injuries to contractile and cytoskeletal muscle fibre components. Acta Physiol Scand 171:321-326 (2001).
9. Merkies, I.S., Faber, C.G. Outcome measures in Duchenne muscular dystrophy: are we ready for the new therapeutic era? Neuromuscul Disord 19 : 447 (2009).
10. Nagaraju, K., Willmann, R. Developing standard procedures for murine and canine efficacy studies of DMD therapeutics: report of two expert workshops on "Pre-clinical testing for Duchenne dystrophy": Washington DC, October 27th-28th 2007 and Zurich, June 30th-July 1st 2008. Neuromuscul Disord 19 : 502-506 (2009).
11. Proske, U., Allen, T.J. Damage to skeletal muscle from eccentric exercise. Exerc Sport Sci Rev 33 : 98-104 (2005).
12. Warren, G.L., Lowe, D.A., Armstrong, R.B. Measurement tools used in the study of eccentric contraction-induced injury. Sports Med 27 : 43-59 (1999).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.