Passaging cellule staminali neuronali

Nota: Per la coltura di routine dei nostri hNSPCs, cambiamo 50-100% dei media a giorni alterni e di solito li passaggio 01:02 una volta alla settimana. La cultura dei media contiene il 20% BIT-9500, 1X fattori antibiotica / antimicotica, e la crescita (EGF, FGF, PDGF e ciascuno a 40 ng / ml) in DMEM: F12 i media di base.

Preparazione del Flask patinate e Dissociare le celle

1. Per preparare nuovi palloni per le cellule diversi passaggi, cappotto fiasche T25 con 10 mg / ml fibronectina umana in Emem per 4 ore, o durante la notte, a 37 ° C di coltura tissutale incubatore. Poco prima passaging le cellule, rimuovere la soluzione fibronectina e risciacquare i palloni con PBS.
2. Trasferire il vecchio "condizionato" media dalle cellule da diversi passaggi per il nuovo fibronectina rivestite palloni (in modo tale che la metà del volume finale di media per ogni pallone sarà la "condizione" media). Queste condizioni di coltura contribuiscono a mantenere queste cellule nel loro stato indifferenziato.
3. Una volta che tutti i media viene rimosso dalle cellule di diversi passaggi, lavare le cellule una volta con PBS. Fare attenzione a secco non fuori le cellule.
4. Aggiungi cellulare dissociazione Buffer (CDB) direttamente sulle celle (1,0-1,5 ml per un pallone T25). Incubare le cellule nel buffer per circa 5 minuti a temperatura ambiente. Picchiettando delicatamente il pallone contribuirà ad accelerare il distacco delle cellule.

Centrifugazione, risospensione, e celle placcatura

1. Aggiungi siero contenenti media (DMEM: F12 con il 10% di siero siero fetale bovino) (usare ~ 3 volte il volume di CDB) al pallone con le cellule distaccata. Rimuovere il supporto e le cellule in una provetta da 15 ml. Utilizzare un piccolo volume di fresca siero contenente i media per sciacquare il pallone e recuperare le cellule residue.
2. Centrifugare i media e le celle a 1000 giri (~ 200xg) per 5 minuti.
3. Aspirazione fuori il siero contenenti media e risospendere le cellule in terreni di coltura fresco, pipettando su e giù per ottenere una sospensione omogenea cellulare.
4. Trasferire la metà delle cellule risospese in ogni pallone nuovo per una frazione di 1:2. Si noti il ​​nuovo numero passaggio sul pallone.

Abbiamo scoperto che questo protocollo offre culture affidabile hNSPCs. Un fattore critico per le nostre cellule è che hanno bisogno di essere mantenuto il più culture piuttosto denso e non possono essere diversi passaggi al punto che le cellule sono scarse. Nelle nostre mani, le culture sparse crescono molto lentamente o cessare completamente divisione. Per questo motivo, siamo soliti suddividere le nostre culture 1:2 o 1:3 quando una cultura è estremamente denso. Rivestimento della superficie di un piatto cultura con fibronectina è importante in quanto favorisce l'attaccamento e la migrazione delle cellule buone, ma, a differenza di laminina, permette anche l'uso di Cell dissociazione Buffer (CDB) per staccare le cellule. Attaccamento alla cellula laminina è troppo forte e richiede l'uso di un enzima proteolitico (es. tripsina) per il distacco delle cellule. Non enzimatica CDB è preferito a tripsina dal taglio proteolitico delle proteine ​​della superficie cellulare può portare a cambiamenti morfologici in hNSPCs nel tempo. Inoltre, hNSCPs coltura nei media condizionata aiuta a mantenere queste cellule nel loro stato indifferenziato.