Passaging células-tronco neurais

Nota: Para cultura de rotina do nosso hNSPCs, mudamos 50-100% dos meios de comunicação todos os dias e, geralmente, a passagem deles 01:02 uma vez por semana. A cultura da mídia contém BIT-9500 20%, 1X fatores antibiótico / antimicótico e crescimento (EGF, FGF, PDGF e cada um com 40 ng / ml) em DMEM: F12 media base.

Preparando o balão revestido e Dissociar as células

1. Para preparar novos frascos para as células várias passagens, casaco T25 frascos com 10 mg / ml fibronectina humana no EMEM por 4 horas, ou durante a noite, em um 37 ° C a cultura de tecidos incubadora. Direito antes passaging as células, remova a solução fibronectina e enxaguar os frascos com PBS.
2. Transferir o velho "condicionados" media a partir de células a ser várias passagens para o novo fibronectina revestido balões (de tal forma que metade do volume final de mídia para cada frasco será o "condicionada" de mídia). Estas condições de cultivo ajudar a manter essas células em seu estado indiferenciado.
3. Depois de todos os meios de comunicação é removida das células para ser várias passagens, lavar as células uma vez com PBS. Tome cuidado para não secar as células.
4. Adicionar celular dissociação Buffer (CDB) diretamente sobre as células (1,0-1,5 ml para um frasco T25). Incubar as células no buffer por cerca de 5 minutos à temperatura ambiente. Batendo o frasco vai ajudar a acelerar o desprendimento de células.

Centrifugação, ressuspensão e Células Plating

1. Adicionar soro contendo media (DMEM: F12 com 10% inativado pelo calor soro fetal bovino) (use ~ o volume de 3X CDB) para o frasco com as células destacadas. Remova a mídia e as células para um tubo de 15 ml. Use um pequeno volume de soro fresco contendo mídia para lavar o balão e recuperar as células residual.
2. Centrifugar a mídia e as células a 1000 rpm (~ 200xg) por 5 minutos.
3. Sucção fora da mídia contendo soro e ressuspender as células em meio de cultura fresco, pipetando para cima e para baixo para fazer uma suspensão celular homogênea.
4. Transferência de metade das células ressuspenso em cada frasco novo para um split 1:2. Anote o número de nova passagem sobre o frasco.

Descobrimos que este protocolo proporciona culturas confiável de hNSPCs. Um fator crítico para as nossas células é que elas precisam ser mantidas como culturas bastante densa e não pode ser várias passagens a tal ponto que as células são esparsas. Em nossas mãos, culturas esparsas crescem muito lentamente ou deixam completamente de se dividir. Por essa razão, costumamos dividir nossas culturas 1:2 ou 1:3 quando uma cultura é extremamente densa. Superfície do revestimento de uma placa de cultura com fibronectina é importante, pois promove a ligação célula boa e migração, mas, ao contrário de laminina, que também permite o uso de celular dissociação Buffer (CDB) para destacar as células. A adesão a laminina é muito forte e requer o uso de uma enzima proteolítica (por exemplo, a tripsina) para desprendimento de células. Não-enzimática CDB é preferível a tripsina desde clivagem proteolítica de proteínas de superfície celular pode levar a alterações morfológicas no hNSPCs ao longo do tempo. Além disso, hNSCPs cultura nos meios de comunicação condicionado ajuda a manter essas células em seu estado indiferenciado.