Passaging mänskliga neurala stamceller

Obs: För rutinmässig odling av våra hNSPCs, vi ändrar 50-100% av media varannan dag och oftast passagen dem 1:02 gång i veckan. Kulturen medier innehåller 20% BIT-9500, 1X antibiotika / antimykotika och tillväxtfaktorer (EGF, FGF och PDGF vardera 40 ng / ml) i DMEM: F12 basen medier.

Förbereda Coated Flask och ta avstånd Celler

1. För att förbereda nya flaskor för passerats celler, päls T25 kolvar med 10 mikrogram / ml humant fibronektin i EMEM i 4 timmar eller över natten, i ett 37 ° C vävnadskultur inkubator. Precis innan passaging cellerna, ta bort fibronektin lösningen och skölj kolvar med PBS.
2. Överför gamla "betingade" media från celler som skall passerats till den nya fibronektin-belagda kolvar (så att halva slutliga volymen av media för varje kolv kommer att vara "villkorat" media). Dessa odling villkor hjälper till att hålla dessa celler i sitt odifferentierade tillstånd.
3. När allt material tas bort från celler som skall passerats, spola cellerna en gång med PBS. Var noga med att inte torka ut i cellerna.
4. Lägg Cell Dissociation Buffer (CDB) direkt på celler (1,0-1,5 ml för en T25 kolv). Inkubera cellerna i bufferten i ca 5 minuter i rumstemperatur. Försiktigt trycka kolven kommer att hjälpa till att snabba upp cellen lossnar.

Centrifugering, Resuspending och celler Plating

1. Lägg serum innehållande media (DMEM: F12 med 10% värmeinaktiveras fetalt bovinserum) (använd ~ 3X volymen CDB) till kolven med fristående celler. Ta bort media och celler till en 15 ml koniska rör. Använd en liten mängd färskt serum innehållande media att skölja kolven och återhämta kvarvarande celler.
2. Centrifugera i media och celler vid 1000 rpm (~ 200xg) i 5 minuter.
3. Sug bort serum innehållande media och återsuspendera cellerna i färska kulturmedia pipettera upp och ned för att göra en homogen cellsuspension.
4. Överföring hälften av den återsuspenderade celler till varje ny kolv för ett 01:02 split. Notera den nya passagen nummer på kolven.

Vi har funnit att detta protokoll ger tillförlitliga kulturer hNSPCs. En kritisk faktor för våra celler är att de måste hållas som tämligen tät kulturer och kan inte passerats till den grad att cellerna är gles. I våra händer, glesa kulturer växer mycket långsamt eller helt upphör att dela sig. Av denna anledning delar vi oftast våra kulturer 1:2 eller 1:3 när en kultur är mycket tät. Beläggning ytan av en kultur fat med fibronektin är viktigt eftersom det främjar god cellbindning och migration, men till skillnad från laminin, även tillåter användningen av Cell Dissociation Buffer (CDB) för att lösgöra cellerna. Cellbindning till laminin är för stark och kräver användning av en proteolytiska enzym (t ex trypsin) för cell lossnar. Icke-enzymatiska CDB är att föredra framför trypsin sedan proteolytisk klyvning av proteiner cellytan kan leda till morfologiska förändringar i hNSPCs över tiden. Dessutom hjälper odling hNSCPs i betingad media upprätthålla dessa celler i sitt odifferentierade tillstånd.