Western blotting Met behulp van de Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Gelelektroforese

Technische noot: Voor het starten van de procedure, hebben uw eiwit monsters klaar.

Tijdens deze eerste stap worden de eiwitten in het monster gescheiden op basis van hun moleculair gewicht met behulp van denaturerende polyacrylamide gel elektroforese (PAGE). De NuPAGE ® LDS Sample Buffer geladen met Lithium dodecylsulfaat (LDS) houdt Polypeptiden in een gedenatureerde toestand zodra het eiwit monster is verwarmd op 70 ° C gedurende 10 minuten. Een sterk reductiemiddel wordt gebruikt in combinatie met secundaire en tertiaire structuur (DTT, om disulfidebindingen te breken) te verwijderen. Daarnaast worden monsters eiwitten behandeld in de negatief geladen LDS en dus door de mazen van de acrylamide gel bewegen in de richting van de positief geladen elektrode. Dit maakt hun scheiding op basis van moleculair gewicht (gemeten in kilo Dalton, kDa).

Gedetailleerde stap-voor-stap protocollen voor de monstervoorbereiding en de PAGE procedure is te vinden op de website van Invitrogen ^2, of in de NuPAGE technische gids ^3.

Technische tips

1. In de Invitrogen NuPAGE Bis-Tris discontinous buffer systeem, de elektroforetische mobiliteit van de eiwitten en de daaropvolgende scheiding bereik van de gel is afhankelijk van twee factoren: i) de acrylamide concentratie van de gel (met een grotere concentratie acrylamide wat resulteert in betere resolutie van de lagere moleculair gewicht eiwitten) en ii) de achterstand ion van de lopende buffer, MOPS of MES. Voor het kiezen van de juiste combinatie voor de scheiding bereik dat je wilt bereiken, verwijzen naar de Gel Migratie grafiek ^1. De dikte van de gel en het aantal putten is afhankelijk van het volume en de hoeveelheid van de monsters die je van plan bent om respectievelijk laden,.
2. Wanneer u uw samples laden in putjes van de gel, is ten minste een rijstrook gereserveerd voor een moleculair gewicht marker (of ladder). Deze eiwitten normen zijn verkrijgbaar bij verschillende bedrijven en bestaan ​​meestal uit een mengsel van lood eiwitten met molecuulgewichten gedefinieerd, zodat de zichtbare banden waarmee u de migratie vorderingen te volgen vorm. Kies een reeks molecuulgewichten die compatibel is met uw gel resolutie.
3. Om tot een mooi en zelfs migratiepatroon adviseren wij het laden van al de putten van je gel met een vergelijkbaar volume van het monster of 1x LDS sample buffer.

Overdracht

Technische noot: Voordat u begint met de overdracht stap, de voorbereiding van de overdracht buffer (1x met 10% methanol) en de pre-afkoelen tot 4 ° C in een koude kamer.

Om de eiwitten toegankelijk is voor opsporing van antilichamen te maken, worden ze overgebracht door electroblotting van de gel op een nitrocellulose membraan. De eiwitbinding is gebaseerd op hydrofobe interacties, evenals laden interactie tussen het membraan en eiwit.

(Polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan kan ook worden gebruikt als een alternatief. In dit geval is het PVDF membraan moet pre-nat worden in methanol minstens 30 seconden voor het gebruik.)

Een gedetailleerde stap-voor-stap protocol van de overdracht procedure is te vinden in referentie 4 als u de Bio-Rad Mini Trans-Blot Elektroforetische Transfer Cell, of in referenties 2-3 als uw lab is uitgerust met de Invitrogen's XCell II ™ Blot Module.

Als resultaat van dit proces worden de eiwitten blootgesteld op een dunne oppervlaktelaag en klaar voor de detectie. De uniformiteit en de algemene doeltreffendheid van de overdracht van eiwitten uit de gel op het membraan kan worden gecontroleerd door de kleurstof membraankleuring de omkeerbare Ponceau S.

Ponceau S kleuringsprocedure (optioneel):

1. Na de overdracht van de eiwitten, plaats het membraan in een incubatie tray (eiwitten naar boven).
2. Voeg genoeg Ponceau S Kleuring aan het membraan en van ten minste 30 seconden incuberen onder zacht schudden.
3. Spoel membraan met gedestilleerd water totdat de achtergrond is duidelijk.
4. Destain het membraan met stromend gedestilleerd water voor 2-3 minuten.
5. Plaats het membraan in het blokkeren van oplossing (zie hieronder).

Technische tips:

1. We raden de etikettering van uw membraan met een potlood voor de eiwit-overdracht in om de kant waar de eiwitten werden blootgesteld en de oriëntatie van uw monsters aan te duiden.
2. Beide Ponceau S kleuring en het moleculair gewicht markers kunnen worden gebruikt om het membraan na overdracht geknipt voor het sonderen van de resulterende delen met verschillende antilichamen

Immunodetectie:

Technische noot: Dit immunodetectie procedure wordt geleverd als slechts een richtlijn. Optimalisatie kan nodig zijn voor elke mieribody; specifieke informatie kan gevonden worden in de meeste data-sheets van de commercieel verkrijgbare antilichamen (bijvoorbeeld, werkverdunning, incubatietijd, etc.).

Tijdens dit laatste proces, zal het doelwit eiwit worden gedetecteerd met behulp van een specifiek antilichaam en zal verschijnen als een band op de film. De positie van de band is afhankelijk van het molecuulgewicht van het target proteïne, terwijl de band intensiteit is afhankelijk van de hoeveelheid van target eiwit aanwezig is.

Doorgaans wordt dit bereikt na drie deelstappen:

1. Blocking: Om niet-specifieke interacties van het antilichaam te voorkomen met het membraan (de overtollige ruimte op het membraan is bedekt met een verdunde oplossing van een generieke eiwit).
2. Probing: Het eiwit van belang wordt gedetecteerd door een specifiek primair antilichaam . Na de ongebonden primaire antilichaam is weggespoeld, is het membraan blootgesteld aan een ander antilichaam gekoppeld aan de reporter enzym , mierikswortel peroxidase (HRP). Deze secundaire antilichaam is gericht tegen de soort-specifieke deel van het primaire antilichaam (bijvoorbeeld een anti-konijn secundair antilichaam zal binden aan een konijnen-source primair antilichaam).
3. Detectie: een chemiluminescentie middel wordt gebruikt als een substraat dat zal luminesceren wanneer ze worden blootgesteld aan de HRP op de secundaire antilichaam. Deze reactie produceert luminescentie op zijn plaats en in verhouding tot de hoeveelheid eiwit gepeild. Het licht wordt vervolgens gedetecteerd door een fotografische film.

Een generieke stap-voor-stap procedure wordt hieronder gegeven. Andere gedetailleerde procedures zijn te vinden in de ECL Plus Western blotting Detection Reagentia handleiding ⁵ of in de meeste data-sheet bij de handel verkrijgbare antilichamen. Incubatietijd, antilichaamverdunning, en het blokkeren en was oplossingen moeten empirisch worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam.

Immunodetectie procedure:

1. Blokkeer de niet-specifieke binding door incubatie met voldoende volume van de PBS 1% caseïne, het blokkeren van oplossing voor het hele membraan te dekken. Leg ze op een rocker gedurende minstens 30 minuten op kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
2. Incubeer het membraan met uw primaire antilichaam (specifiek voor het eiwit van belang). Het primaire antilichaam moet worden verdund in het blokkeren van oplossing. Voor de meeste antilichamen, is volledig bindend bereikt na 1-2 uur incubatie bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Als alternatief kan de incubatie stap 's nachts worden uitgevoerd bij 4 ° C om de signaal-ruisverhouding te verhogen.
3. Verwijder de oplossing (gooi of bij 4 ° C tot -20 ° C voor herhaaldelijk gebruik te houden) en snel een keer wassen het membraan. Dan 3x10 minuten met PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) bij kamertemperatuur met krachtig schudden.
4. Incubeer het membraan met een HRP-gekoppelde tweede antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing. Kies een antilichaam dat de IgG gedeelte van de soort waar de primaire antilichaam werd opgewekt herkent. De incubatie wordt uitgevoerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
5. Gooi de oplossing weg en snel een keer wassen het membraan. Dan 3x10 minuten met PBST bij kamertemperatuur met krachtig schudden.
6. Ga verder naar de chemiluminescentie-detectie volgens de fabrikant instructie. We gebruiken de ECL Plus Western blotting detectie reagentia van GE Healthcare (zie referentie 5 voor specifieke instructies).
7. Plaats uw membraan in Saran Wrap of een zakje en leg in een autoradiografie cassette. Zorg ervoor dat er geen vocht uitlekken en alle luchtbellen te verwijderen.
8. Expose de fotografische film membraan in een donkere kamer. Begin met een 1 minuut belichtingstijd en aanpassen aan de gewenste intensiteit van het signaal.

Technische tips:

1. Het blokkeren van niet-specifieke binding wordt bereikt door het plaatsen van de membraan in een verdunde oplossing van eiwit. We gebruiken meestal 1% caseïne, maar bovine serum albumine (~ 2% BSA) of niet-vette droge melk (~ 5%) kan worden gebruikt als een alternatief.
2. Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) kan gebruikt worden tijdens de gehele procedure in plaats van PBS. Wij raden u aan TBS als u van plan uw membraan sonde met phosphospecific antilichaam.
3. Het gebruik van een glow-in-the-dark sticker (bijvoorbeeld Stratagene's Glogos ® II Autorad Markers) tikte in de bodem van de autoradiografie cassette zal u helpen om uw film en je membraan af te stemmen tijdens de analyse stap.

Analyse

Nu dat u uw film blootgesteld, zul je beseffen dat in de praktijk, niet alle Westerns eiwitten laten zien als een leuke single band. Additional bands kunnen ook worden weergegeven als gevolg van de niet-specifieke binding van zowel de primaire en secundaire antilichamen. Deze achtergrond signaal kan worden verminderd door het optimaliseren van de immunodetectie procedure. Daarnaast zal een passende controle (bijvoorbeeld ongetransfecteerde cellen, siRNA-behandelde cellen, enz.) nuttig zijn om de specificiteit van uw antilichaam en de exacte locatie van het doelwit eiwit op het membraan te bepalen.

Na markering op de film de positie van de gekleurde eiwit standaard bands uit het membraan, plot de log van elke moleculair gewicht van het eiwit normen (y-as) tegen de bijbehorende relatieve mobiliteit (x-as). Relatieve mobiliteit (Rf) is de term die gebruikt wordt voor de verhouding van de afstand die het eiwit is verhuisd van haar punt van oorsprong (top van de gel) ten opzichte van de afstand die de tracking kleurstof of een laag moleculair gewicht marker is verhuisd (de gel voorkant) . Bepaal de regressielijn van de standaard curve om waarden voor de helling en de y-as te verkrijgen. De onbekende moleculair gewicht (grootte) van uw doelgroep eiwit wordt geschat met behulp van de Rf en de volgende gewijzigde vergelijking:

log moleculair gewicht = (helling) (mobiliteit of Rf van het doelwit eiwit) + y-as

(Zie referentie 6 voor gedetailleerde instructies).

Expressieniveau benaderingen worden genomen door het vergelijken van de band intensiteit van het doelwit eiwit aan dat van een structurele eiwit (bijvoorbeeld, tubuline of actine) of een huishoudelijke genproduct, zoals GAPDH. Deze zogenaamde "loading control" mag niet veranderen tussen de monsters en wordt onthuld met behulp van een specifiek primair antilichaam. Het beeld kan verder worden geanalyseerd door densitometrie om de relatieve hoeveelheid van eiwitkleuring evalueren en kwantificeren van de resultaten in termen van optische dichtheid.

De procedure hier gepresenteerde maakt gebruik van een Bis-Tris gel met MES draait buffer als een voorbeeld van de denaturering PAGE het gebruik van de Invitrogen NuPAGE Novex elektroforese-systeem. Daarnaast is deze pre-cast gel systeem maakt het mogelijk scheiding van eiwitten onder denaturerende of niet-denaturerende omstandigheden en is geschikt voor een breed scala aan moleculaire gewichten (1-200 kDa voor de Bis-Tris gels naar 36-400 kDa voor de Tris- Acetaat gels). Afhankelijk van uw experiment, kunt u ervoor kiezen om slechts een deel van de westelijke-blotting techniek die hier beschreven te volgen en direct gel kleuringen procedures (bv zilver of Coomassie kleuring) of een alternatieve immunodetectie methode (bijvoorbeeld, colorimetrische of fluorescerend) te gebruiken.

We routinematig de Invitrogen NuPAGE Novex elektroforese systeem te gebruiken in ons laboratorium voor verschillende toepassingen, kan een paar voorbeelden van die terug te vinden in de referenties 7-9.