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 JoVE Bioengineering

비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

1, 2, 1, 3, 2

1Department of Materials Science and Engineering, MIT - Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Mechanical Engineering, MIT - Massachusetts Institute of Technology, 3HST Center for Biomedical Engineering and Harvard Stem Cell Institute, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

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Cite this Article: 비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

Lee, C., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns. J. Vis. Exp. (48), e2640, doi:10.3791/2640 (2011).

Abstract: 비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

비대칭 수용체 패턴에 압연에 의해 흐름에 직교 세포의 측면 변위는 세포 1 라벨이없는 분리 및 분석을위한 새로운 장치의 개발을위한 기회를 제공합니다. 이러한 장치는 지속적인 흐름 분리, 또는 다른 셀 또는 phenotypes 수용체 표현의 수준을 구별하기 접착력을 조절 수용체 패턴 측면 변위를 사용할 수 있습니다. 수용체 - 패턴 기판의 셀 압연 궤도의 본질을 이해하는 것은 기판과 같은 장치의 설계 기술이 필요합니다.

여기, 우리는 세포 압연 접착력 2를 지원 비대칭 수용체 패턴에 셀 압연의 탄도를 연구를위한 프로토콜을 보여줍니다. P - selectin 수용체의 잘 정의된, μm의 규모 패턴이 흐름 챔버에 통합되었습니다 골드 코팅 슬라이드에 microcontact 인쇄를 사용하여 가공되었습니다. PSGL - 1 리간드 3 표현 HL60 세포 무늬 라인의 들판을 가로질러 거듭하고 거꾸로 명시야 현미경에 시각되었습니다. 세포는 측면 편향 1 결과 패턴의 경사 가장자리를 따라 굴러 및 추적. 각 세포는 일반적으로 패턴 가장자리를 따라 일정한 거리 (모서리 추적 길이로 정의)를 압연 가장자리에서 분리하고, 다운 스트림 패턴 reattached. 이 분리가 어려운 흐름 챔버의 출구 입구에서 세포의 전체 궤적을 추적할 수 있습니다 있지만, 입자 추적 소프트웨어는 그들이 하나의 수용체에 이동하는 때 시간 동안 세포의 압연의 탄도를 분석하고 항복하는 데 사용된 - 패턴 라인. 궤도는 다음 셀 롤링 판매율과 다른 패턴으로 각 셀의 가장자리 추적 길이의 배포판을 얻기 위해 조사되었다.

이 프로토콜은 수용체 패턴에 세포 회전 궤도를 quantifying과 패턴 각도 및 전단 응력 등이 엔지니어링 매개 변수를 관련된 유용합니다. 이러한 데이터는 레이블이없는 세포 분리 및 분석을위한 microfluidic 장치의 설계에 유용합니다.

Protocol: 비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

1. 롤링 HL60 세포

1.1. 문양의 기판 제작.

  1. 골드 코팅 유리 슬라이드에 PEG 분자의 자기 조립 monolayers을 (샘스) 교체하기 위해 microcontact 인쇄 (μCP) 4-7 사용 : α = 10의 경사 각도와 수용체의 패턴을 정의 microcontact 인쇄 polydimethylsiloxane (PDMS) 우표를 조작 SU - 8 성형 공정에 의해 °. 20 분 피라 냐는 물고 기지 너한테 솔루션 (황산의 혼합 3시 1분 30 % 과산화수소로)와 금 표면을 청소하고 사용하기 전에 24.5 ° C에서 풍부한 디 물로 표면을 씻어. 에탄올의 5mM PEG 솔루션 잉크 PDMS 스탬프를. 20 분 동안 공중에 우표를 건조시킵니다. 부드럽게 40 초에 대한 황금의 표면에 도장을 넣고 금 표면과 스탬프 사이 좋은 연락 방법이 있는지 확인하십시오. 초과 압력이 필요하지 않습니다. 에탄올로 표면을 씻어 N 2의 흐름에 따라 그것을 건조.
  2. 24.5에서 3 시간 동안 재관류 챔버 (전자 현미경 과학)를 사용 ° C 패턴 P - selectin과 함께 남아있는 지역. P - selectin 솔루션 (15 μg / DPBS에 ML) 내에 기판을 품어 풍부한 DPBS로 표면을 씻어.
  3. Backfill 1 H를위한 BSA (DPBS 1 MG / ML)로 표면이 아닌 특정 상호 작용을 차단합니다. 풍부한 DPBS로 표면을 씻어.

1.2. 세포는 흐름 회의소에서 실험 롤링.

  1. 직사각형 흐름 챔버의 패턴 표면을 통해 HL60 세포 (~ 10 5 셀 / ML (); 폭 W = 1.0 cm, 길이 = 6cm, Glycotech, Inc의 높이 H = 0.0127 cm)의 정지를 흐름 24.5에서 ° C. 0.5 dyn / cm 2 (~ 0.05 PA) 주변에 대응하는 전단 응력과 75 μL / 분 유량을 생성하기 위해 주사기 펌프 (세계 정밀 계측기, SP230IW)를 사용합니다. τ 비행기 Poiseuille 흐름 방정식 판매량 유량입니다 Q μ는 동점도 (0.001002 아빠들)입니다 τ는 = 6μQ/wh 2를 사용하여 전단 응력을 계산, W는 흐름 챔버의 넓이이며, H는의 높이입니다 흐름 챔버.
  2. 300 기간이 일반적으로 초당 1 프레임의 속도로, 4를 사용하여 접착제 P - selectin 기판과 상호 작용을 압연 HL60 세포를 기록하기 위해 장착된 카메라 (Andor iXon 885) × 목적으로 거꾸로 현미경 (니콘 TE2000 - U)를 사용하여 S. 각 전단 응력의 크기와 패턴 경사 각도 세 독립적인 실험을 수행합니다. 각 실험에서 얻은 평균 값을 의미 및 표준 편차로 제시 데​​이터입니다.
  3. 데이터 분석.
    패턴 라인 가장자리를 따라 트랙을 생성하는 프리웨어 8 추적 입자를 이용한 사용자 정의 Matlab (Mathworks, 주식 회사) 프로그램으로 이미지 시퀀스를 분석합니다. P - selectin 밴드의 끝부분까지 연장 트랙이 선택 두 개의 직선 세그먼트 장착되어 있습니다 - 흐름에 부합 하나, 패턴 가장자리에 부합 다른. 이 두 세그먼트는 다음 가장자리에 속도를 압연하고, 일반 지역에 속도를 압연, 가장자리 추적 길이를 계산하는 데 사용됩니다.

2. 대표 결과 :

그림 1
그림 (A)는 4 × 목표를 사용하여 접착제 P - selectin 기판과 HL60 압연 상호 작용의 동영상 변환 현미경 이미지 중 하나를 보여줍니다. 밝고 어두운 지역은 각각, P - selectin 수용체와 PEG 지역과 일치합니다. 그림 (B)는 맞춤형 Matlab 프로그램을 사용하여 얻은 트랙을 보여줍니다. 가장자리 경사 각도는 10 °와 전단 응력은 0.5 dyn / cm 2이었다. 에지 추적 길이, L E, 변위, D, 그리고 모서리에 각각 밴드, V E와 V P, 내부 압연 판매율이 (C - 1) 그림에 설명되어 있습니다. 그림은 (C - 2) 보여줍니다 에지 추적 길이 분포 (기록된 세포의 수를.) Insets은 L E의 평균 가치와 가장자리에 압연 속도 (V E)를 표시하고 경사 각도에서 밴드 (V P) 내부 α = 10 ° 및 0.5 dyn / cm 2 주위의 유체 전단 응력의 ​​크기. 오차 막대는 하나의 표준 편차, N = 각 조건 3 복제 실험 (3 복제 표면). 나타냅니다

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Discussion: 비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

우리는 microcontact 인쇄 2를 사용 가공 비대칭 수용체 - 패턴 표면에 세포 회전 궤도를 조사하기 위해 프로토콜을 설명합니다. PEG와 P - selectin 영역 사이의 명확한 대비를 보여주는 패턴 표면의 광학 현미경 이미지는 스탬핑이 성공적인지 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 샤프, 직선 가장자리는 스탬핑이 잘 수행하면 볼 수 있습니다. 하드 스탬프 누르면 패턴의 정밀도를 제한 스탬프 변형이 발생할 수 있습니다. 물결 모양 가장자리는 잉크 농도가 너무 높으 또는 스탬핑 시간이 너무 긴 경우 얻을 수 있습니다. 우표와 표면 사이의 접촉 불량은 우표의 크기 (<0.5 cm 2) 너무 작은 경우가 아닌 균일한 PEG 패턴 발생합니다. 비 - 신선한 잉크 솔루션 때문에 P - selectin을 passivate 감소 능력의 PEG - 패턴 영역에서 압연 세포가 발생할 수 있습니다. 실제 경사 각도가 표면과 상호 작용하지 않습니다 자유 흐르는 세포의 패턴과 궤도의 영상으로부터 계산하실 수 있습니다. 실험은 여기에 패턴 가장자리를 따라 이벤트를 압연 개별 세포에 대한 수익률 정보를 설명하지만, 그것은 자동으로 한 패턴에서 분리하여 다른 패턴에 다시 부착 세포를 추적하기 어렵습니다. 패턴 간격 변경 예를 들어, 여러 개의 모서리가 발생한 단일 셀 추적 활성화 수도 있습니다. 이 기능은 단일 세포 수준에서 다른 압연 특성과 세포 사이의 구별에 대한 높은 해상도를 사용합니다. 세포 롤링 문제는 세포의 리간드에 따라, 우리는 이러한 실험 9-12 자신의 압연 행동 3의 차이에 따라 서로 다른 세포 phenotypes을 분리하는 적절한 패턴의 디자인을 활성화 수도 가설. 이 작품은 따라서 세포 리간드와 패턴 비대칭 수용체 간의 상호 작용에 따라 세포의 분리 및 분석을위한 장치의 디자인에 유용할 수 있습니다.

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Disclosures: 비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements: 비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

이 프로젝트는 MIT에서 기술 혁신에 대한 Deshpande 센터 (RK와 JMK)와 화학 및 생물 분판 프로그램을 통해 RK로 NSF 경력 보너스 0,952,493에 의해 지원되었다. 우리는 솔저 Nanotechnologies (외설) 및 시설의 사용을위한 MIT의 마이크로 기술 연구소 (MTL)에 대한 연구소 주셔서 감사합니다.

Materials: 비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

Name Company Catalog Number Comments
Human promyelocytic leukemia cells ATCC CCL-240 HL60 cells
Gold-coated glass slides EMF TA134 Gold slides
(1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 674508 PEG
Recombinant human P-selectin R&D Systems ADP3-050 P-selectin
Bovine serum albumin Rockland Immunochemicals BSA-50 BSA
Dulbecco’s phosphate buffered saline Mediatech, Inc. 21-030 DPBS
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 339741
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 316989

References: 비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

  1. Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8, (4), 1153-1158 (2008).
  2. Lee, C.-H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir, 27 (1), 240 249 (2011).
  3. Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K., Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood 86, (12), 4417-4421 (1995).
  4. Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. Printing patterns of proteins. Langmuir 14, (9), 2225-2229 (1998).
  5. James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir 14, (4), 741-744 (1998).
  6. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 25, 55-78 (1996).
  7. Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir 18, (2), 519-523 (2002).
  8. http://physics.georgetown.edu/matlab/
  9. Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress 24, (5), 1052-1059 (2008).
  10. Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73, (2), 111-124 (2001).
  11. Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A 71A, (3), 470-479 (2004).
  12. Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A.C., Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir 23, (3), 983-987 (2007).

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