Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi

1. Haddeleme HL60 hücre

1.1. Desenli Yüzeyler imalatı.

1. Altın kaplamalı cam slaytlar PEG moleküllerinin kendi kendini monte mono tabakaları (SAMs) alternatif yapmak microcontact baskı (μCP) ^4-7 kullanma: α = 10, eğim açısı ile reseptör desenleri tanımlanan microcontact baskı polidimetilsiloksan (PDMS) pulları Üretiyor SU-8 kalıplama işlemi °. 20 dakika boyunca altın piranha çözüm (sülfürik asit 03:01 karışımı% 30 hidrojen peroksit) ile yüzeyi temizleyin ve sonra, bol DI su ile 24.5 ° C önceden az yüzey durulayın. Etanol 5mM PEG solüsyonu ile Mürekkep PDMS damgası. 20 dakika boyunca hava damga kurulayın. 40 saniye süreyle yavaşça altın yüzeyinde pul koymak ve altın yüzey arasında iyi bir iletişim ve damgası olduğundan emin olun. Aşırı basınç gerek yoktur. Etanol ile yüzey N ₂ akışı altında durulayın ve kurulayın.
2. Yüzey 24,5 az 3 saat boyunca perfüzyon odası (Elektron Mikroskobu Bilimleri) kullanarak ° C desen P-selektin ile diğer alanlar. P-selektin çözüm (15 mg / DPBS mL) içinde inkübe Yüzey bol DPBS ile durulayın.
3. Dolgu BSA (DPBS 1 mg / ml) ile yüzey 1 saat non-spesifik etkileşimleri engellemek için. Yüzey bol DPBS ile durulayın.

1.2. Hücre Akış Odası Rolling Deneyler.

1. HL60 hücreleri (~ 10 ⁵ hücre / ml) (genişliği w = 1,0 cm, uzunluğu = 6 cm; Glycotech, Inc yüksekliği h = 0,0127 cm) dikdörtgen bir akış odasında desenli yüzeyler üzerinde bir süspansiyon Akış 24.5 ° C 75 mcL / dak akış hızı üretmek için yaklaşık 0.5 dyn / cm ² (~ 0.05 Pa) karşılık gelen kayma gerilmesi, bir şırınga pompası (Dünya Hassas Aletler, SP230IW) kullanın . Kayma gerilmesi τ uçağın Poiseuille hacimsel debisi Q μ kinematik viskozitesi (0.001002 Pa ler) τ = 6μQ/wh ^2, akış denklemi kullanarak hesaplayın, w akışını odasının genişliği ve h yüksekliği akış odasına.
2. 300 süreleri için genellikle saniyede 1 kare hızında, 4 kullanarak yapışkan P-selektin yüzeyler ile etkileşim haddeleme HL60 hücreleri kaydetmek için monte edilmiş bir kamera (Andor IXON 885) × amacı ile bir inverted mikroskop (Nikon TE2000-U) kullanın s Her kayma gerilmesi büyüklüğü ve desen eğim açısı için üç bağımsız deneyler, gerçekleştirin. Her deneyden elde edilen ortalama değerler ortalama ve standart sapma gibi mevcut veri.
3. Veri Analizi.
   Görüntü dizileri bir parçacık desenli hat kenarlarında parçaları üretmek için ücretsiz ⁸ izleme kullanılan özelleştirilmiş bir Matlab (Mathworks, Inc.) Programı tarafından analiz edin. P-selektin bandının sonuna kadar uzanan parçalar seçilir ve iki düz çizgi parçaları ile donatılmış akışı ile uyumlu bir desen kenarı ile uyumlu diğer. Bu iki parça daha sonra kenarına hız haddeleme, ve düz bir bölgeye hız haddeleme, kenar izleme uzunluğunu hesaplamak için kullanılır.

2. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil (A) 4 × amacı kullanarak yapışkan P-selektin yüzeylerde HL60 haddeleme etkileşimleri video dönüştürülür mikroskop görüntülerini bir gösterir. Parlak ve koyu bölgeler sırasıyla, P-selektin reseptör ve PEG bölgelere karşılık gelir. Şekil (B) özelleştirilmiş bir Matlab programı kullanılarak elde parçalarını gösterir. Kenar eğim açısı 10 ° ve kayma gerilmesi 0.5 dyn / cm ² idi. (C-2), kenar izleme uzunluğu, _l e, deplasman, d ve kenarında ve haddeleme hızları sırasıyla bantlar, _{V e} ve _V p, içinde, (C-1) Şekil olarak açıklanmıştır. Şekil gösterir kenar izleme uzunluğu dağılımı (kaydedilen hücrelerinin sayısı). Insets l _e ortalama değer ve kenarında haddeleme hızı (V _e) ve (V _p), eğim açısı, bantları içinde α = 10 ° ve sıvı shear stresin büyüklüğü 0.5 dyn / ^cm 2 civarında . Hata çubukları, bir standart sapma, n = 3, her durum için çoğaltmak denemeleri (3 çoğaltmak yüzeyler) temsil

Biz microcontact baskı ² kullanılarak üretilen asimetrik reseptör desenli yüzeyler hücre haddeleme yörüngeleri incelemek için bir protokol tanımlanmıştır. PEG ve P-selektin alanlar arasında belirgin kontrast gösteren desenli yüzey optik mikroskop görüntüleri damgalama başarılı olup olmadığını teyit etmek için kullanılabilir. Keskin, düz kenarlar damgalama iyi yapıldığında görülebilir. Hard damga basarak desen hassas sınırlar damga deformasyona neden olabilir. Dalgalı kenarları mürekkep konsantrasyonu çok yüksek veya damgalama süresi çok uzun zaman elde edilebilir. Damga boyutu çok küçük (<0.5 cm ²⁾ zaman damgası ve yüzey arasındaki Kötü temas üniform olmayan PEG desen yol açar. Sigara taze mürekkep bir çözüm, çünkü P-selektin etkisizleştirmek için azalmış kabiliyet PEG desenli bölgeleri üzerinde yuvarlanan hücrelerinde neden olabilir. Gerçek eğim açısı, yüzeyler ile etkileşim değil, serbest akan hücrelerinin desen ve yörüngeleri görüntüleri hesaplanabilir. Deney desen kenarlarında yuvarlanma olaylar bireysel hücre hakkında bilgi verim açıklanan, ancak bunu otomatik olarak bir desen ayırmak ve başka bir desen üzerinde yeniden takmak hücreleri izlemek için zordur. Desen aralıkları değiştirme, örneğin, tek bir hücrenin birden fazla kenarları karşılaşmadan izlemeyi etkinleştirmek olabilir. Bu yetenek, tek hücre düzeyinde farklı haddeleme özelliklere sahip hücreler arasındaki ayrım daha yüksek çözünürlük sağlar. Haddeleme davranış hücre hücre ligandlar bağlı olarak, bu tür deneyler uygun desen ^{tasarımı, 9-12 3,} haddeleme davranış farklılıkları dayalı farklı hücre fenotipleri ayrı etkinleştirebilirsiniz hipotez . Bu çalışma, bu nedenle cihazların tasarımı için hücre ligandlar ve desenli asimetrik reseptörleri arasındaki etkileşim dayalı hücre ayırma ve analizi için yararlı olabilir.