El estudio de las trayectorias celular Rolling en los patrones del receptor asimétrica

1. HL60 celular móvil

1.1. Fabricación de sustratos con dibujos.

1. Utilizando impresión por microcontacto (μCP) ^4-7 para alternar las monocapas autoensambladas (SAMs) de las moléculas de PEG en el portaobjetos de vidrio recubierto de oro: Fabricar microcontacto impresión polidimetilsiloxano (PDMS) sellos que definen los patrones del receptor con un ángulo de inclinación de α = 10 ° por un SU-8 proceso de moldeo. Limpie la superficie de oro con una solución de pirañas (3:1 mezcla de ácido sulfúrico al 30% de peróxido de hidrógeno) durante 20 minutos y luego enjuague la superficie con abundante agua DI a 24,5 ° C antes de su uso. El sello de tinta con una solución de PEG PDMS 5 mM en etanol. El sello seco en el aire durante 20 minutos. Suavemente ponga el sello en la superficie del oro durante 40 segundos y asegúrese de que haya un buen contacto entre la superficie del oro y el sello. No hay un exceso de presión es necesaria. Enjuague la superficie con etanol y se seca bajo una corriente de N _2.
2. Incubar el sustrato dentro de la P-selectina solución (15 mg / ml en DPBS), utilizando una cámara de perfusión (Microscopía Electrónica de Ciencias) durante 3 horas a 24,5 ° C al patrón de las áreas restantes con la P-selectina. Enjuague la superficie con abundante DPBS.
3. El relleno de la superficie con BSA (1 mg / ml en DPBS) durante 1 h para bloquear interacciones no específicas. Enjuague la superficie con abundante DPBS.

1.2. Los experimentos en células Rolling una cámara de flujo.

1. El flujo de una suspensión de células HL60 (~ 10 ⁵ células / ml) sobre las superficies estampadas en una cámara de flujo rectangular (Glycotech, Inc; ancho w = 1,0 cm, longitud = 6 cm, la altura h = 0.0127 cm) a 24,5 ° C. Use una bomba de jeringa (Instrumentos del Mundo de precisión, SP230IW) para generar el caudal de 75 l / min, correspondiente a la tensión de corte en torno al 0,5 dinas / cm ² (~ 0,05 Pa). Calcule el esfuerzo cortante τ mediante el uso de la ecuación del plano de Poiseuille flujo de τ = 6μQ/wh ^2, donde μ es la viscosidad cinemática (0,001002 Pa s), Q es el caudal volumétrico, w es el ancho de la cámara de flujo, y h es la altura de la cámara de flujo.
2. El uso de un microscopio invertido (Nikon TE2000-U) con una cámara montada (Andor ixon 885) para registrar las células HL60 rodar interacciones con adhesivo P-selectina sustratos con un 4 × objetivo, por lo general a un ritmo de 1 fotograma por segundo para una duración de 300 s. Realizar tres experimentos independientes para cada magnitud esfuerzo cortante y el ángulo de inclinación del patrón. Presentar los datos como media y desviación estándar de los valores promedio obtenidos en cada experimento.
3. Análisis de datos.
   Analizar las secuencias de imágenes de una medida Matlab (The Mathworks, Inc.) que utilizó un programa de rastreo de partículas gratuito de ⁸ a generar pistas a lo largo de los bordes con patrones. Las pistas se extiende hasta el final de una banda de P-selectina se seleccionan y se dispone de dos segmentos de línea recta - que está alineada con el flujo y el otro alineado con el borde del patrón. Estos dos segmentos se utilizan para calcular la longitud de borde de seguimiento, poniendo la velocidad en el borde, y la velocidad de balanceo en la región de llanura.

2. Los resultados representativos:

La figura (A) muestra una de las imágenes del microscopio convertido en el vídeo de HL60 interacciones de laminación con adhesivo P-selectina sustratos utilizando un objetivo × 4. Regiones brillantes y oscuras corresponden a P-selectina receptor y regiones PEG, respectivamente. Figura (B) muestra las pistas obtenidas mediante un programa personalizado de Matlab. El ángulo de inclinación ventaja fue de 10 ° y el esfuerzo de corte fue de 0,5 dinas / cm ^2. La longitud de seguimiento de borde, l _e, el desplazamiento, d, y las velocidades de balanceo en el borde y dentro de las bandas, V _E y _P V, respectivamente, se describen en la figura (C-1). Figura (C-2) muestra la distribución (el número de células registradas) de longitud de la arista de seguimiento. El recuadro muestra el valor promedio de l _e y la velocidad de rotación en el borde (V _e) y dentro de las bandas (V _p) en el ángulo de inclinación α = 10 ° y la magnitud de líquido esfuerzo de corte en torno al 0,5 dinas / cm ^2. Las barras de error representan la desviación estándar, donde n = 3 replicar los experimentos (3 superficies de réplica) para cada condición.

Se ha descrito un protocolo para examinar células trayectorias rodando por patrones asimétricos receptor de las superficies fabricadas con impresión por microcontacto ^2. Las imágenes de microscopio óptico de la superficie de estampado que muestra un claro contraste entre el PEG y áreas de P-selectina se puede utilizar para confirmar si es sellado con éxito. Los bordes afilados, directamente se puede observar cuando el sellado se realiza bien. Presionando duro de la marca puede dar lugar a la deformación que marca los límites de la precisión de los patrones. Los bordes curvados se pueden obtener cuando la concentración de tinta es demasiado alta o el sellado de tiempo es demasiado largo. Mal contacto entre el sello y la superficie conduce a patrones de PEG no uniforme cuando el tamaño del sello es muy pequeña (<0,5 cm ^2). No fresco solución de tinta puede dar lugar a células rodando por el PEG-patrón regiones a causa de disminución de la capacidad para neutralizar la P-selectina. El ángulo de inclinación real se puede calcular a partir de imágenes de los patrones y las trayectorias de flujo libre células que no están interactuando con las superficies. El experimento descrito aquí proporciona información sobre la celda individual rodar eventos a lo largo de los bordes patrón, sin embargo, es difícil hacer un seguimiento de forma automática las células que se desprenden de un patrón y volver a colocar en otro patrón. Cambiar el espacio de patrones, por ejemplo, puede habilitar el seguimiento de una sola célula encuentro con múltiples aristas. Esta capacidad puede permitir una mayor resolución para distinguir entre las células con diferentes características de balance en el nivel de células individuales. Como el comportamiento celular móvil depende de los ligandos en la célula, la hipótesis de que tales experimentos pueden permitir el diseño de los patrones adecuados para separar los diferentes fenotipos de células basadas en las diferencias en su comportamiento de laminación ^{3, 9-12.} Este trabajo lo que puede ser útil para el diseño de dispositivos para la separación celular y el análisis basado en la interacción entre los ligandos y los receptores de la célula patrón asimétrico.