Studiare Traiettorie cellulare Rolling Patterns Receptor asimmetrica

1. HL60 cellula rotolamento

1.1. Fabbricazione di Patterned substrati.

1. Utilizzando stampa microcontact (μCP) ^4-7 per rendere alternati monostrati auto-assemblati (SAM) di molecole di PEG sull'oro rivestita vetrini: Realizzare microcontatto stampa polidimetilsilossano (PDMS) francobolli che ha definito i modelli recettore con angolo di inclinazione α = 10 ° con uno SU-8 processo di stampaggio. Pulire la superficie d'oro con soluzione piranha (3:1 miscela di acido solforico al 30% di perossido di idrogeno) per 20 minuti e risciacquare la superficie con abbondante acqua deionizzata a 24,5 ° C prima dell'uso. Dell'inchiostro il timbro PDMS con soluzione PEG 5mM in etanolo. Il timbro a secco in aria per 20 minuti. Gentilmente messo il timbro sulla superficie di oro per 40 sec e assicurarsi che ci sia un buon contatto tra la superficie d'oro e il timbro. Nessuna pressione in eccesso viene richiesto. Lavare la superficie con etanolo e asciugare sotto un flusso di N _2.
2. Incubare il substrato all'interno di P-selectina soluzione (15 mg / mL in DPBS) utilizzando una camera di perfusione (Scienze della Microscopia Elettronica) per 3 ore a 24,5 ° C a modello le restanti aree con P-selectina. Lavare la superficie con abbondante DPBS.
3. Backfill la superficie con BSA (1 mg / mL in DPBS) per 1 ora per bloccare non specifiche interazioni. Lavare la superficie con abbondante DPBS.

1.2. Cellula di Rolling Esperimenti in una camera di flusso.

1. Flusso di una sospensione di cellule HL60 (~ 10 ⁵ cellule / ml) sulla superficie lavorata in una camera di flusso rettangolare (Glycotech, Inc; larghezza w = cm 1,0; lunghezza = 6 cm, altezza h = 0,0127 centimetri) a 24,5 ° C. Utilizzare una pompa a siringa (Strumenti di precisione mondiale, SP230IW) per generare la portata di 75 microlitri / min, con corrispondente sforzo di taglio di circa 0,5 dyn / cm ² (~ 0,05 Pa). Calcolare sforzo di taglio τ utilizzando l'aereo equazione del flusso di Poiseuille 6μQ/wh τ = ^2, dove μ è la viscosità cinematica (0,001002 Pa s), Q è la portata volumetrica, w è la larghezza della camera di flusso, ed h è l'altezza del camera di flusso.
2. Utilizzare un microscopio invertito (Nikon TE2000-U), con una telecamera montata (Andor ixon 885) per registrare le cellule HL60 rotolamento interazioni con adesivo P-selectina substrati con un 4 × obiettivo, di solito ad una velocità di 1 fotogramma al secondo per la durata di 300 s. Eseguire tre esperimenti indipendenti, per ogni grandezza sforzo di taglio e angolo di inclinazione del modello. Presentare i dati come media e deviazione standard dei valori medi ottenuti da ciascun esperimento.
3. Analisi dei dati.
   Analizzare le sequenze di immagini da una personalizzata Matlab (MathWorks, Inc.), programma che utilizzava una particella di tracciamento freeware di ⁸ a generare binari lungo i bordi linea di fantasia. Tracce di estendere fino alla fine di un P-selectina band sono selezionati e dotati di due segmenti di linea retta - uno allineato con il flusso, l'altro in linea con il bordo del modello. Questi due segmenti sono poi utilizzati per calcolare la lunghezza di tracciamento bordo, velocità di rotazione sul bordo, e la velocità di rotolamento sulla regione pianura.

2. Rappresentante dei risultati:

Figura (A) mostra una delle immagini al microscopio convertito dal video di HL60 interazioni laminazione con adesivo P-selectina substrati con un 4 × obiettivo. Regioni chiare e scure corrispondenti a P-selectina recettore e regioni PEG, rispettivamente. Figura (B) mostra le tracce ottenute con un programma personalizzato di Matlab. L'angolo di inclinazione limite era 10 ° e la tensione di taglio è stato dello 0,5 dyn / cm ^2. La lunghezza di tracciamento bordo, l _posta, spostamento, d, e le velocità di rotolamento sul bordo e all'interno della band, V _{e P} e V, rispettivamente, sono descritti nella figura (C-1). Figura (C-2) mostra la distribuzione (il numero di cellule registrato) della lunghezza del bordo di monitoraggio. Riquadri mostrano il valore medio di l _e la velocità di rotolamento e sul bordo (V _e) e all'interno della band (V _p) presso l'angolo di inclinazione α = 10 ° e la portata del fluido sforzo di taglio di circa 0,5 dyn / cm ^2. Le barre di errore rappresentano una deviazione standard, dove n = 3 esperimenti di replicare (3 superfici replica) per ogni condizione.

Abbiamo descritto un protocollo per esaminare le cellule che rotola su traiettorie asimmetriche recettore fantasia superfici fabbricate utilizzando stampa microcontact ^2. Le immagini al microscopio ottico di superficie modellata che mostra il contrasto evidente tra PEG e P-selectina aree possono essere usati per confermare se stampaggio è successo. Sharp, bordi dritti si può osservare quando la timbratura viene eseguita bene. Dura pressione del bollo può causare deformazioni timbro che limita la precisione dei modelli. Bordi ondulati possono essere ottenuti quando la concentrazione di inchiostro è troppo alto o il tempo di stampaggio è troppo lungo. Bad contatto tra il timbro e la superficie porta a non uniforme modelli PEG quando la dimensione del timbro è troppo piccolo (<0,5 cm ^2). Non-soluzione fresca d'inchiostro può causare cellule rotolamento sul PEG-fantasia regioni a causa della diminuita capacità di passivazione P-selectina. L'angolo di inclinazione reale può essere calcolato a partire dalle immagini del modello e traiettorie di flusso libero cellule che non interagiscono con le superfici. L'esperimento descritto qui le informazioni sui rendimenti delle singole celle rotolamento eventi lungo i bordi modello, tuttavia, è difficile tenere traccia automaticamente delle cellule che si staccano da un modello e ricollegare su un altro modello. Modificare la spaziatura modello, per esempio, può attivare il rilevamento di una singola cellula incontrando bordi multipli. Questa capacità può consentire una risoluzione più alta per distinguere tra le cellule con differenti caratteristiche di rotolamento a livello di singola cellula. Come il comportamento delle cellule rotolamento dipende dalla ligandi sulla cellula, ipotizziamo che tali esperimenti può consentire la progettazione di modelli appropriati per separare fenotipi cellulari diversi in base alle differenze nel loro comportamento rotolamento ^{3, 9-12.} Questo lavoro può quindi essere utile per la progettazione di dispositivi per la separazione delle cellule e l'analisi sulla base di interazione tra ligandi delle cellule e dei recettori disegni asimmetrici.