Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice. J. Vis. Exp. (7), e265, doi:10.3791/265 (2007).

Zwei-Photonen-Imaging hat eine elegante Choreographie von Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und bei der Initiierung einer Immunantwort ¹ zeigte. Hier präsentieren wir Methoden zur adoptiven Transfer von markierten T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten als erste in 2002 ² beschrieben. Zwei-Photonen-Imaging von Immunzellen setzt voraus, dass die Zellen fluoreszierend markiert sind, entweder durch Färbung mit einer Zelle tracker Farbstoff oder die Expression eines fluoreszierenden Proteins. Wir zeigen die adoptiven Transfer Verfahren der Injektion von Zellen vom Spender-Mäusen in die Schwanzvene eines Empfängers Tier, wo sie die Heimat von lymphatischen Organen innerhalb von ca. 15-30 min. Abgeleitete Wir zeigen die Isolierung von einem Lymphknoten und beschreiben Methoden, um die ordnungsgemäße Montage der herausgeschnittenen Lymphknoten zu gewährleisten. Andere Überlegungen wie die korrekte Sauerstoffversorgung des perfundierten Medien, Temperatur und Laserleistung werden diskutiert. Schließlich präsentieren wir 3D-Videobilder von naiven CD4 + T-Zellen präsentiert steady state Motilität bei 37 ° C.

1. Adoptiven Transfer von Zellen:

Schwanzvene oder intraokulare Injektion sowohl geeignete Methoden für die Einführung der Zelle tracker-markierten oder fluoreszierenden Protein-exprimierenden Lymphozyten. In diesem Video. wir zeigen, adoptiven Transfer von Zellen durch Schwanzvene Injektion.

a. Materialien

CD4 + T-Zellen sind mit 1,4 uM CFSE für 30 Minuten bei 37 º C gekennzeichnet, zweimal gewaschen, und in 100 ul RPMI-1640 resuspendiert. Die Zellen werden in ein steriles 28 Stärke Insulin Spritze zur Injektion geladen. Die Anzahl der Zellen richtet sich nach dem Experiment getan. Typischerweise sind 5 Millionen T-Zellen ausreichend für einfache T-Zell-Visualisierung. Ein Nagetier restrainer für die Maus benötigt wird, um Verletzungen des Tieres und sich selbst zu verhindern.

b. Die Sicherung der Tier-

Die Maus ist für adoptiven Transfer von langsam Unterstützung des Tieres in das Nagetier restrainer (siehe Video) und das offene Ende der Röhre durch leichtes Herunterdrücken des Kolbens gesichert. Nicht loslassen der Maus Schwanz während dieses Prozesses, da einige kleinere Tiere können umdrehen im restrainer. Diese Methode verhindert, dass das Tier von einer Verletzung selbst und von beweglichen während der Injektion. Beim Einrichten der Nager restrainer, nicht drücken Sie den Kolben in weiteren als notwendig, um das Tier aus Springen nach vorn zu behalten. Auch tun nicht den Kolben gegen das Tier, und nicht aus dem Tier in der restrainer für einen längeren Zeitraum.

c. Visualisierung der Schwanzvene

Ziehen Sie das Heck zu Ihnen, so dass es leicht ist, über den Zeigefinger gewickelt und hielt gegen die Innenseite des Fingers durch den Daumen. Identifizieren Sie die Schwanzvenen auf beiden Seiten des aufrechten Schwanzes entfernt. Die Visualisierung ist durch die Erwärmung der Schwanz mit warmem Wasser, dann wischte sich mit Ethanol erleichtert.

d. Die Injektion von Zellen

Wenn die Vene gefunden wurde, legen Sie die Spritze Kegel-Seite nach oben in einem flachen Winkel parallel zur Ader. Einmal in die Vene, sanft drücken Sie den Kolben, und wenn du in die Vene werden sollte keinen Widerstand gegen die Injektion. Wenn es irgendeinen Widerstand, entfernen Sie die Spritze und versuchen Sie es erneut an einem anderen Ort.

Wenn Sie in die Vene sind, langsam drücken Sie den Kolben, bis die Injektion abgeschlossen ist. Die Rute sollte nicht während der Injektion aufgetrieben. Wenn ja, würde dies bedeuten, dass die Nadel nicht in die Vene. Es ist möglich, "verlieren" die Vene bei der Injektion. Wenn dies geschieht, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie Ihr Injektion an einer anderen Stelle. Wenn Sie mehr als eine Injektion versuchen müssen, ist es am besten, den Schwanz nach oben in Richtung der Körper der Maus aus der ursprünglichen Einstichstelle. Planen Sie im Voraus für diese Möglichkeit, indem Sie nach distal auf dem Schwanz, um sich selbst Raum für einen weiteren Versuch an die Adoptiveltern übertragen.

e. Post-Injektion Überlegungen

Nach der Injektion abgeschlossen ist, wird eine kleine Rückfluss des Blutes aus den Venen auftreten. Drücken Sie vorsichtig die Einstichstelle mit einem, bis die Blutung aufhört sauber wischen. Entfernen Sie den Kolben und lassen Sie das Tier nach vorne zu gehen, aus dem restrainer, während sanft Festhalten an der Rute.

Immer mit Ihrem Tierpflege Ausschuss und Nutzung von Tieren Protokolle überprüfen, um sicherzustellen, Sie sind im Einklang. Es ist wichtig, die Praxis dieser Technik mehrere Male, bevor Sie versuchen das echte Experiment.

2. Lymph Node Isolation

Isolation von Lymphknoten für Zwei-Photonen-Imaging erfordert eine sorgfältige Entfernung der richtige Lymphknoten aus dem umgebenden Gewebe.

a. Auswahl und Lage der peripheren Lymphknoten

Auswahl der Lymphknoten für die Bildgebung auf den experimentellen Ziele abhängen. Seien Sie sich bewusst von einer lokalen Infektion oder Spritz-Lymphknoten, und wählen Sie den entsprechenden Knoten für die Bildgebung. Der Artikel von Van den Broeck et al., Beschreibt die Lage und Morphologie der murinen Lymphknoten in detail ^3. In diesem Video zeigen wir, das Ausschneiden von sechs großen peripheren Lymphknoten, die sich für Zell-Isolierung oder Bildgebung.

b. Lymphknoten-Entfernung:

Denken Sie daran, die Integrität des Gewebes beim Entfernen Lymphknoten. Achten Sie darauf, nicht zum Bruch der Kapsel oder in irgendeiner Weise Schaden den Lymphknoten Struktur. Der Verlust der Lymphknoten strukturelle Integrität beeinträchtigt die experimentieren. Falls notwendig, entfernen Sie Fett aus den Lymphknoten Oberfläche mit feinen Zerlegung (# 5 Dumont) Pinzette unter einem Binokular. Lymphknoten sollten keine verbleibende Fett auf der Oberfläche des Knotens, da dies Bildgebung durch Streuung des Lichts im Dunkeln.

Proper Exzision von Lymphknoten ist auch eine wichtige Technik, um vor dem ersten realen Experiment Praxis.

3. Lymph Node Imaging-Setup und Überlegungen

Die Lymphknoten sollte die Bildgebung der Bühne, die in diesem Fall aus einem vertieften Kammer gesichert werden. Erwärmt, Sauerstoff-perfundierten Medien wird in die Kammer von einer Seite mit einer Schlauchpumpe und Durchlauferhitzer gepumpt, und es tritt über eine nach unten abgestufte Kanal in einen Sammelraum mit einer Vakuumröhre zu einer Sammelstelle Kolben. In unserem System ist die Lymphknoten in 37 ° C getaucht Medien und mit medizinischem Carbogen (5% CO _2, 95% O ₂₎ super-perfundiert. Die Temperatur der Perfusion Medien sollten möglichst nahe an den Lymphknoten erfasst werden, wie es möglich ist. Ihr spezielles System kann verlangen, Variationen in den Medien Durchfluss und Bühnenbild an das Mikroskop Bühne und Ziel unterzubringen.

a. Lymphknoten Imaging-Setup:

Wie in dem Video zu sehen, sichern wir die Lymphknoten, indem Sie zuerst Anbringen es, medulläre-Seite nach unten (auf Bild T-oder B-Zell-Zonen mit einem aufrechten Mikroskop), um eine Kunststoff-Deckglas, zugeschnitten auf die entsprechende Größe. Es ist wichtig, eine ungiftige Gewebekleber (wir verwenden VetBond ™ von 3M Corporation) zu verwenden.

Das Deckglas wird in der strömenden Medien, indem Sie einen kleinen Klecks Silikonfett an der Unterseite des Deckglases gesichert, dann haften diese auf das Glas Basis der bildgebenden Kammer.

b. 2-Photonen-Imaging-Überlegungen:

Mehrere Faktoren können dazu führen Lymphozyten nicht mehr bewegt: Temperatur zu hoch oder zu niedrig ist; mehr Laserleistung, Kompression oder andere Schäden an den Lymphknoten, und der Mangel an Sauerstoff. Schäden durch übermäßige Laserleistung oder Temperaturen> ~ 39 ° C ist irreversibel.

Wenn Zellen dim sind, ist es normalerweise besser, den Detektor zu gewinnen oder die Zell-Kennzeichnung Protokoll anstatt mit einem höheren Laserleistung, um Zellen zu visualisieren zu erhöhen. Optimierung der Kennzeichnung oder die Expression von fluoreszierenden Proteinen erforderlich, um die Fluoreszenz über dem Niveau des Hintergrund-Autofluoreszenz zu bringen. Mit angemessenen Gewinn-und Laser-Energie-Einstellungen, etwa zwei-log Verschiebung der Fluoreszenz über dem Ausgangswert (gemessen mittels Durchflusszytometrie) ist sinnvoll für die Zell-Visualisierung.

Mit abstimmbaren Zwei-Photonen-Laser, sollte die Wellenlänge für die Anregung verwendet werden etwas weniger als das Doppelte der Single-Photonen-Anregung des Fluorophors wird abgebildet. In Zwei-Photonen-Experimente mit mehr als einem Etikett oder fluoreszierende Protein kann es notwendig sein, zu experimentieren mit der Anregungswellenlänge verwendet werden, um die optimalen Einstellungen für beide Labels zu finden. Zwei-Photonen-Anregung kann auch zu Bild endogene Kollagen-Strukturen unter Ausnutzung der inneren blauen Erzeugung der zweiten Harmonischen verwendet werden. Second Harmonic Generation (SHG) liegt vor, wenn zwei Photonen innerhalb eines Materials kombiniert und emittieren ein einzelnes Photon mit der doppelten Frequenz des ursprünglichen Photonen. Im Gewebe tritt Zwei-Photonen-Anregung, wenn das einfallende Laserlicht senkrecht zu einer hoch geordneten Proteinstruktur wie Kollagen.

Praktische Fragen der Zwei-Photonen-Imaging wurden in der Vorschau ansehen ^{4, 5} diskutiert.

In diesem Video-Protokoll zeigen wir die Verfahren für Adoptiv-Zell-Transfer und Lymphknoten isoliert und die Vorbereitung für bildgebende Lymphozyten Motilität in einem peripheren Lymphknoten erforderlich. Zwei-Photonen-Imaging hat mehrere Vorteile gegenüber konfokale Bildgebung in beiden explantierten Gewebe (hier abgebildet) und in intravital Vorbereitungen. Insbesondere von Infrarot-Anregung verwenden minimiert Streulicht und erlaubt die Abbildung ~ 300 Mikrometer unter der Kapsel des Lymphknotens und tiefer in einigen Geweben ^4. Darüber hinaus ist Multi-Photonen-Anregung, um den Brennpunkt des Objektivs begrenzt und minimiert Foto Bleich-und Gewebeschäden aus Seite der Fokalebene. Wie bei jeder neuen Technik ist jedoch, Zwei-Photonen-Imaging kein Allheilmittel und ihre Grenzen und mögliche Fallstricke zu beachten ⁵ gehalten werden. Unter diesen ist die Forderung, dass - mit Ausnahme intrinsische Signale wie Erzeugung der zweiten Harmonischen von Kollagen-Zellen von Interesse sind fluoreszierend durch extrinsische Sonden oder durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen markiert werden. Der Eindruck ist so angelegt, dass diese markierten Zellen werden in einem schwarzen Leere schwimmen, während in Wahrheit sind sie in getaucht, und die Interaktion mit einem komplexen Umfeld von Strukturelementen und unzähligen anderen unbeschrifteten, unsichtbare Zellen.

In den sechs Jahren seit Einführung der Zwei-Photonen-Imaging zur Immunologie, hat diese Technik Forschern erlaubt, langjährige Fragen direkt Visualisierung in intakten lebenden Geweben Prozesse einschließlich Zell-Zell-Interaktionen, Zell-Motilität und Lokalisierung, zelluläre Signalwege und zytotoxische Zelladresse Töten Veranstaltungen. Das Feld hat sich schnell über den anfänglichen phänomenologischen Beschreibungen entwickelt und quantitative Analysen zusammen mit Computer-Modellierung und Simulation beginnen jetzt zu spüren, wie die scheinbar chaotische zelluläre Bewegungen und Interaktionen in Lymphknoten führen zu einer effizienten Immunantwort zu machen. Dieser Fortschritt ist umfassend in einer kürzlich erschienenen Publikation ^1, der über 100 Papiere beschreiben die Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie für immunoimaging Listen überprüft.

Wir wollen Rebecca Paquette für die Unterstützung bei Reagenzzubereitung danken. MPM wird von einem Ruth L. Kirchstein Promotionsstipendium von der National Institutes of Health und der Unterstützung durch Stipendien GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP) auch von den National Institutes of Health unterstützt.

1. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol (2008).

2. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science 296, 1869-73 (2002).

3. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods 312, 12-9 (2006).

4. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol 2, 872-80 (2002).

5. Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol 6, 497-507 (2006).

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