Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

1. Introdução

A cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas usando magnético-activated cell sorting (LIMACS) técnica foi desenvolvida em nosso laboratório para isolar complexos ceramida-proteína associada ^1-3. Originalmente, as vesículas lipídicas eram feitas de ceramida e fosfatidilserina, o que permitiu a MACS usando partículas magnéticas conjugado com anexina V (altamente afim de fosfatidilserina) para isolar as vesículas e suas proteínas associadas. Temos usado a técnica para o LIMACS na reconstituição in vitro de um complexo de polaridade ceramida-associado eo isolamento de ceramida proteínas de ligação de célula lisados ^​​3. LIMACS pode ser modificada usando outros parceiros de interação para o isolamento das vesículas (por exemplo, glicolipídeo-specifc lectinas ou anticorpos lipídica).

2. Procedimentos experimentais

Preparação de vesículas lipídicas e Ensaios aPKCBinding

1. Vesículas lipídicas são obtidos a partir de misturas secas de quantidades equimolares de fosfatidilserina (105 mg) e C16-ceramida (85 mcg), seguindo procedimentos modificados para a preparação de lipossomas grandes ^1,4-7.
2. As misturas de lipídios são, então, ressuspenso e sonicado por 1 h em 100 l de tampão vesícula consistindo de 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) e 150 mM NaCl.
3. Depois de adicionar 300 ml de tampão vesícula suplementado com 0,1 mM MnCl _2, as amostras são centrifugadas a 12.000 g por 20 min μ a 4 ° C.
4. O pellet (vesículas lipídicas grande) é ressuspenso em 100 ul de tampão vesícula e incubadas com 1 nmol de Vybrant CM-dii por 1 hora a 37 ° C para visualizar a fração vesícula após a separação MACS. Vybrant CM-DII é um corante vermelho fluorescente especificamente incorporando em membranas lipídicas.
5. Um detergente livres lisado celular é preparado por sonicação / homogeneização das células em 300 ml de tampão hipotônico (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) com protease e os inibidores da fosfatase), seguida pela remoção de detritos membranosa por centrifugação. A etapa de centrifugação a 100.000 xg por 1 h deve ser adicionado para evitar a contaminação do lisado celular com membranas endógena contendo fosfatidilserina.
6. O lisado limpo é adicionado à suspensão vesícula de lipídios, ea mistura é incubada por 2 horas a 4 ° C.
7. A mistura de reação é complementado com 20 l de tampão 20x anexina V vinculativo e 50 ul de uma solução contendo esferas magnéticas conjugadas a anexina V seguido de incubação por 1 hora a 4 ° C.
8. MACS é realizada de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec, Inc.) protocolo. A presença ea quantidade de vesículas lipídicas é determinada através do monitoramento da fluorescência CM-dii Vybrant nas frações de fluxo e eluição utilizando uma leitora de microplacas de fluorescência.
9. A correlação linear entre a quantidade de lipídios vesicular e intensidade de fluorescência da vesícula-bound Vybrant CM-dii é verificada pela quantitativa de alto desempenho cromatografia em camada fina (HPTLC) da mistura de lipídios aplicada a anexina V-Macs.
10. A especificidade da reação de ligação de proteínas aPKC ou outros, para as vesículas ceramida / fosfatidilserina é verificada por um ensaio de competição de anticorpos usando 1 mg de anticorpo anti-coelho PKCζ policlonais para incubar o lisado celular por 1 hora a 4 ° C antes da incubação com os lipídios vesículas.
11. A proteína de ligação a ceramida / fosfatidilserina vesículas no eluato MACS é analisada por SDS-PAGE e immunoblotting.

In vitro complexa polaridade lipídios proteínas

1. A reconstituição in vitro de um complexo de proteína-lipídica polaridade é realizada seguindo o procedimento LIMACS como descrito na seção anterior. Em resumo, fosfatidilserina (420 mg) e C16-ceramida (107 mg) é seco a partir de solvente orgânico.
2. Os lipídios são secas sob sonicação ressuspenso em 500 mL de tampão vesícula (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).
3. Cinco mL de 10 mM MnCl2, 1 ml de Vybrant CM-DII, e 500 ng de PKCζ (recombinante humana) é adicionada ea mistura de reação incubada undergentle agitação por 60 min a 4 ° C.
4. Vybrant CM-dii manchada fosfatidilserina / ceramida vesículas são recuperadas por centrifugação a 12.000 xg por 60 min a 4 ° C.
5. O pellet (rosa) é ressuspenso em 100 mL tampão Tris e suplementado com γS-GTP (100 mM), o PIB (1 mM), GST-Par6 (100 ng) ou GST-Cdc42 (500 ng) e mais incubadas por 3 h, a 4 ° C (qualquer outra combinação de proteínas recombinantes de interesse pode ser usado aqui).
6. Anexina V-tampão (5 mL de uma solução estoque 20x) e anexina V conjugada esferas magnéticas (50 ul) são adicionados a mistura de reação e incubado sob agitação suave por mais 30 min a 4 ° C.
7. Anexina V-MACS é realizada seguindo o protocolo do fornecedor, conforme descrito anteriormente. A fração de eluição (1 ml) é suplementado com 10 mg de ovalbumina puro como ajuda de precipitação. A proteína é concentrado por Wessel-Flügge precipitação e analisados ​​por SDS-PAGE/immunoblotting como descrito anteriormente ^8.
8. A quantidade de vesículas lipídicas eluída é quantificado pela detecção de Vybrant CM-dii (rosa) na fase orgânica (clorofórmio metanol /) da reação de precipitação Wessel Flügge. A quantidade de proteína analisado é normalizado em quantidades iguais de vesículas lipídicas.

3. Resultados

LIMACS purificação de PKCζ-EGFP e do domínio de ligação de ceramida C20ζ-EGFP

A lisado detergente livres de células MDCK expressar comprimento total PKCζ C-terminal ligada à proteína verde fluorescente (EGFP-FLζ) ou um domínio de ligação de ceramida no C-terminal de PKCζ (C20ζ-EGFP) foi incubada com fosfatidilserina / vesículas ceramida como descrito em procedimentos experimentais. Após eluição da coluna de MACS, proteína foi analisada através immunoblotting e anticorpos contra PKCζ e EGFP para detecção da proteína eluída ^2.

Figura 1. LIMACS de EGFP-rotulados PKCζ e seu fragmento C-terminal C20ζ usando fosfatidilserina / ceramida vesículas.

Detergente livres de lisados ​​de células MDCK expressando EGFP (como um controle não vinculativo), comprimento total PKCζ-EGFP, ou a ligação de ceramida, C-terminal de fragmento C20ζ-EGFP foram incubadas com fosfatidilserina / vesículas ceramida tal como descrito na seção de procedimentos experimentais . Depois de usar LIMACS, a proteína foi eluída com tampão de amostra SDS e analisadas por SDS-PAGE e immunoblotting. O painel esquerdo mostra que EGFP não se ligam às vesículas retidos com o V-linked anexina esferas magnéticas. O painel do meio e da direita mostra que o comprimento total PKCζ-EGFP e C20ζ-EGFP foram retidos devido à ligação de ceramida.

Para testar a interação específica entre um lipídio e sua proteína de ligação é prejudicada pela incorporação de lipídios na membrana da célula. A membrana celular consiste de uma mistura de lipídios e proteínas diversas e é organizado em microdomínios lipídicos ou jangadas. Portanto, o co-purificação de proteínas microdomínios e não pode distinguir claramente se uma proteína diretamente liga-se a um lipídio ou só é enriquecido em uma estrutura microdomínio. Outros métodos usando lipídios definido revestido em superfícies como ELISAs lipídios ou ressonância Plasmon espectroscopia pode detectar a interação de um lipídio específico com a sua ligação às proteínas .. No entanto, para determinar essa interação em um ambiente de membrana fisiologicamente relevantes, a superfície (por exemplo, por espectroscopia de ressonância Plasmon) tem de ser revestido com vesículas lipídicas ou lipossomas.

Nós desenvolvemos um romance ensaio de vesícula de lipídios de ligação como uma alternativa a estes métodos anteriores. A novidade vem da incorporação de um lipídio âncora (fosfatidilserina) em vesículas, que permite o isolamento de vesículas lipídicas com anexina V conjugada esferas magnéticas. Portanto, denominado neste ensaio de lipídios cromatografia de afinidade vesícula mediada usando separação de células magnético ativado (LIMACS). LIMACS pode ser realizada para as proteínas endógenas, proteínas expressas nas células ou proteínas recombinantes reconstituído em um complexo de proteínas lipídios ^1-3.

A proteína ligada ao vesículas lipídicas pode ser recuperado, basta tomar a coluna MACS do suporte magnético e eluição com um tampão apropriado. Este pode ser um tampão da enzima compatível para medir a atividade enzimática no eluato ou tampão de amostra SDS para realizar análise de proteínas utilizando SDS-PAGE e immunoblotting. Se usar tampão de amostra SDS coluna MACS não tem de ser removido do suporte magnético, que permite a retenção do esferas magnéticas no stand.

Há precauções a serem tomadas quando se utiliza LIMACS. Evidentemente, LIMACS não pode ser usado com um lisado detergente, porque isso irá destruir o vesículas lipídicas. Além disso, ele tem que ser testado se a proteína de ligação do alvo de lipídios também se liga a fosfatidilserina porque este lipídios é usado como uma âncora para a ligação das vesículas de anexina V conjugada esferas magnéticas. . Em alguns casos, fosfatidilserina pode prejudicar a ligação com a proteína alvo. Portanto, controles negativos e controles com diferentes quantidades de fosfatidilserina têm de ser incluídos no ensaio. Thesecontrols pode ser facilmente executada usando vesículas lipídicas contendo apenas fosfatidilserina ou uma mistura de fosfatidilserina não vinculativos lipídios. Incluindo controles negativos também é necessário para lisados ​​celulares que contêm uma quantidade significativa de fosfatidilserina endógena. Para evitar a contaminação com membranas lipídicas endógenas ou vesículas é recomendado para limpar o lisado celular através da inclusão de uma etapa ultracentrifugação a 100.000 xg por 1 h. É evidente que lipídios proteínas de ligação no sobrenadante só pode ser citosólica, que é uma limitação do procedimento LIMACS. Existe a possibilidade de estender a LIMACS lipídios outra âncora, como GM1 e subunidade B da toxina da cólera conjugado com esferas magnéticas.

Estamos atualmente explorando o uso de lipídios anticorpos específicos para LIMACS, o que tornaria o uso de lipídios âncora para a preparação das vesículas desnecessários. Um dos aspectos benéficos da LIMACS é o isolamento do complexo de proteínas lipídios que permite uma variedade de métodos de análise de proteínas que não são implementáveis ​​.. Por exemplo, temos usado LIMACS para isolar um complexo de proteínas reconstituído polaridade da Par6/Cdc42 associados ceramida-bound aPKC. Portanto, LIMACS é um novo método poderoso para a análise e isolamento de complexos lipídio-proteína associados.