İkincil Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi (Sesi-MS) ile karakterize Bakteriyel uçucu

Bean, H. D., Zhu, J., Hill, J. E. Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS). J. Vis. Exp. (52), e2664, doi:10.3791/2664 (2011).

İkincil elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (Sesi-MS), numune ön işlemesi için gerek kalmadan, hızlı algılama uçucu bileşiklerin için geliştirilmiş bir yöntem. Yöntemi ilk Fenn ve arkadaşları ¹ tarafından tarif edilmiştir ve yasadışı uyuşturucu ² ve patlayıcılar ^{3-4, 5} cilt uçucu karakterizasyonu ve ^6-7 nefes analizi tespiti için tatbik edilmiştir.

Sesi iyonizasyon elektrosprey çözüm ve uçucu analit arasında proton transfer reaksiyonları ile oluşur ve tıpkı geleneksel elektrosprey iyonizasyon (ESI), hetero-organik moleküllerin analizi için çok elverişlidir. Ancak, standart ESI aksine Sesi proton transfer süreci çözüm buhar faz yerine (Şekil 1) oluşur ve bu nedenle Sesi organik uçucu ve aerosollerin tespit etmek için en uygun olan.

Biz bakteriyel belirlenmesi ve tanımlanması ⁸ için bir yöntem olarak bakteriyel Uçucu tespiti Sesi-MS kullanımı genişlemektedir. Sesi-MS uçucu bir istatistiksel analiz yöntemi ile birlikte parmak izi, büyüme ortamı çeşitli bakteriyel cins, tür, ve karışık kültürlerin ayırt etmek için kullanılabilir olduğunu göstermiştir. ⁸ Burada Sesi kullanarak bakteri uçucu parmak izi almak için adımlar sağlar sağlam bakteriyel belirlenmesi ve tanımlanması sağlamak için optimize edilmelidir enstrümantal parametreleri de dahil olmak üzere-MS.

Şekil 1 bakteriyel Uçucu Sesi-MS analizi için şematik. Bakteriyel kültür headspace Sesi reaksiyon odası (2), _{CO 2} (1) yerinden . Uçucu elektrosprey bulut geçmesi Sesi reaksiyon odası hareket ve iyonize olmak (3). Bir kez iyonlaşmış, uçucu, analiz için kütle spektrometresi (4) içine çekti. Aşırı taşıyıcı gaz ve bakteriyel Uçucu girmemiş 0.22 mikron filtre (5) ile ek bir koruma önlemi olarak, geçti, ve kimyasal bir kaput için havalandırmalı. Ankastre: Sesi elektrosprey iğne silika bilenmiş bir iğne ucu kapiller (40 mikron ID).

Sesi-MS kullanımının bakteriyel Uçucu, E. karakterizasyonu için bir gösteri olarak coli K12 ve P. aeruginosa PAO1 37 LB-Lennox, 50 ml 24 saat aerobik kültür ° C ve headspace uçucu Sesi-MS spektrumları 2 dakika içinde toplanır. Karbon dioksit (% 99,99) 2 L / dk akış hızında tepki odasına uçucu teslimat için taşıyıcı gaz olarak kullanılır. Sesi reaksiyon odasında özel inşa edilmiş ve orijinal elektrosprey iyon kaynağı yerine bir API-3000 (SCIEX), monte. Spektrumları,% 0.1 formik asit,% 5.0 metanol, ve 94.9% su (v / v) elektrosprey çözüm olarak kullanarak pozitif iyon modu toplanan 5 teslim bilenmiş bir iğne ucu ile iletken olmayan bir silika kapiller yoluyla nL / s (40 mikron ID). Uygulanan gerilimi 2,5 kV. : 20 - 500 Da, MCA modu, 40 tarar, 3 s / tarama, ve 2 dk toplam analiz süresi Analisti 1.4.2 yazılım (Uygulamalı Biyosistem) veri toplama için aşağıdaki parametreleri ile kullanılır.

1. Kültürleme sistemi

1. Deneme için (örneğin, havalandırma, ışık, sıcaklık, vb) yanı sıra, kütle spektrometresi uçucu verimli teslim türlerin büyüme ihtiyaçları göz önünde bulundurularak, kültürler büyüyen için uygun bir damar seçin. Kullanmayı tercih kültürü şişeleri, en az iki luer portları dişli kapaklar ile donatılmış standart 100 ml Pyrex medya şişe. Bir giriş hattı için bir taşıyıcı gaz numune şişesi ve bir çıkış hattı teslim cihaz VOC teslimat (Şekil 1) için başka bir bağlantı noktası üzerinden eklenir döner bağlantı noktası üzerinden eklenir. Herhangi bir ek port takılı.
2. Önce kültür örnekleri, sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için gemi ve su batığın zorlar. Gaz kaçağı, zayıf ya da hiç uçucu iyon sinyalleri şeklinde atipik bir birincil nedeni.

2. Biyolojik Deneme: set-up ve güvenliği ile ilgili hususlar

1. Hipotezine uygun koşullarda kültürleri büyütün. Bu en az iki biyolojik, her iki teknik çoğaltır çoğaltır, her değişken için kullanıldığından emin tavsiye edilir.
2. Her kültürde durum için boş bir hazırlayın (orta, antibiyotikler, vb) ve örnekleri gibi aynı koşullar altında boş kuluçkaya yatmaktadır.
3. Türlerin biyogüvenlik seviyesi (ler) dikkate alarak, biyolojik ajanlar için kullanmakta olduğunuz uygun güvenlik önlemleri uygulayın.
4. Enstrüman ve gaz nakil hatları canlı biyolojik ajanlar ile kirlenmesini önlemek için, taşıyıcı gaz hattına uygun gözenek boyutu filtre yükleyin. Sesi tepki odasına uçucu transferi ile filtreler müdahale olmaz, ama biraz aerosol transfer verimliliği etkileyebilir ⁶
5. Biyolojik ajanlar dökülüp durumunda uygun çevreleme sağlamak için kültür şişesine gaz transferi kapağını takarken ikincil çevreleme veya bir biyogüvenlik kabini kullanın.
6. Başlatmak ve örnek şişe şişe içindeki basınç inşa etmeyecek bir şekilde taşıyıcı gaz akışı sonlandırmak.

3. Enstrüman optimizasyonu

NOT: Sesi-MS, özellikle örnek uçucu için tasarlanmıştır, bu yüzden cihaz kullanmadan önce kokulu kişisel bakım ürünleri (örneğin, kolonya, diş macunu, losyon, yumuşatıcı), sakız, sigara vb. Kullanımını sınırlamak. Sıkıca laboratuvarda tüm uçucu kimyasallar kap ve hava kontrol testi sırasında mümkün olduğunca taslakları.

Tüm sinyal yoğunluğu ve istikrarını etkileyebilecek aşağıdaki enstrümantal parametreleri, alet ve deney için optimize edilmiş olması gerekir.

1. Elektrosprey çözümü ve akış hızı: işletim enstrüman polarite (pozitif veya negatif iyon modu) ve hedef bileşiklerin moleküler karakteri dikkate alarak, hedeflemek istediğiniz moleküllerin sınıf için uygun elektrosprey çözümü seçin. Bu deneyde elektrosprey çözümü% 0.1 formik asit,% 5.0 metanol,% 94.9 daha az polar moleküller sinyal yoğunluğu artırır su (v / v), while iyi bir sinyal istikrarın sağlanması. Çözüm 5 nL / s akış hızında teslim edilir
2. Taşıyıcı gaz akış hızı: taşıyıcı gaz akış hızı elektrosprey istikrar ve sinyal yoğunluğunu etkileyebilir. CO ₂ (≥% 99.99) 2 L / dk akış hızında burada kullanılır.
3. İğne şekil ve konum: iğne ucu şekil ve konum güçlü bir sinyal yoğunluğu ve istikrarı etkileyebilir. Yeni bir iğne takarken, iğne pozisyonu düşük arka plan, yüksek analit sinyal yoğunluğu ve sinyal istikrar arasında bir denge oluşturmak için optimize edilmesi gerekir. Sesi spektrumları bir iğne değişiklikten sonra yeniden üretilebilmesi için, periyodik kayıtlarına gözlenen spektrum maç kadar iğne konumunu ayarlamak spektrumları toplamak için gereklidir. Kitle spec orifis elektrosprey iğne ucu arasındaki mesafe 1 - 5 mm olacaktır.
4. Uygulanan voltaj: sistemi uygulanan voltaj sinyal iyon yoğunluğu ve elektrosprey Taş koni istikrarı etkiler. Ayrıca, optimum gerilim elektrosprey çözüm ve iğne ucu şeklini bağlıdır. Deney serisinin başında, sisteminiz için en uygun spektrum ve sinyal kararlılığı verimleri gerilim belirlemek ve ardından sonraki tüm deneyler için bu gerilim. Uygulanan gerilimleri 2.0 - 5.0 kV sistemi için en iyi sinyal yoğunluğu ve elektrosprey istikrar sağlar. Bu deneme için 2,5 kV kullanılır.

4. Sesi-MS analizi için açma ve ayarlama

1. Gerilim kaynağının kapalı olduğundan ve sistem elektrik deşarj olmasını sağlayarak başlayın. Gerilim kaynağı üzerindeki gösterge ışıkları sıfır multimetre üzerindeki voltaj sağlanması), 2 kapalı, ve 3), elektrik açar topraklama sağlamak 1) bunu.
2. Denemeniz için uygun elektrosprey çözüm yükleyin.
3. Taşıyıcı gaz açma ve deney için uygun kur akışını ayarlamak.
4. Elektrosprey çözüm reaksiyon odasına teslim başlatmak için elektrosprey rezervuar basınç uygulayın.
5. Gerilim kaynağı açın ve gerilim deneyleri için uygun bir değer için ayarlayabilirsiniz.

NOT: Bu noktada iyonizasyon kaynağı metal yüzeyler tehlikeli bir şok sunma yeteneğine sahiptir. Gerilim kaynağı açıldıktan sonra cihaz etrafında çalışırken çok dikkatli olun.

6. Sesi-MS spektrum uygulanan gerilim ince ayar ayarlamalar yaparken izlenmesi için bir ayarlama yöntemi ayarlayın. Sistemini ve deney için optimize edilmiş olduğunu satın parametrelerini kullanın. Her tarama bağımsız bir spektrum üretir, böylece Çoklu Kanal Toplama (MCA) onay kutusu (eğer varsa) temizleyin, 10 edinimi süresi 15 dakika ve satın alma işlemini başlatmak. Taşıyıcı gaz arka plan Spectra dikkat edilmelidir.
7. Önceki deneyler için CO ₂ taramaları maç istikrarlı bir toplam iyon kromatogram (TIC) ve tekrarlanabilir taramalar elde etmek için uygulanan gerilim ince ayar ayarlamaları yapın. Voltaj ayarlamaları yapıldıktan sonra, aracı stabilize olduğundan emin olmak için beş dakika spektrumları ve bir TIC toplamaya devam.
8. Enstrümantal istikrar satın zamanı ayarlayarak gerektiği gibi veri aralığı ve MCA seçimi örnekleri için uygun olarak satın alma yöntemi, sağlanır. Kayıtlarınız için bir taşıyıcı gaz arka plan spektrum toplayın.

5. Bakteri kültürü uçucu bir parmak izi alma

1. Boş bir spektrum toplamak için, taşıyıcı gaz akış bypass hatları aracılığıyla doğrudan ve daha sonra cihazın gaz nakil hatları (vanalar kapalı) boş bir örnek eklemek.
2. Örnek şişesi vanaları açın ve bypass hatlarının vanalarını kapatınız.
3. 30 saniye reaksiyon odasında nem dengeleyici ve bu süre boyunca, sistemi denge sağlaması için izin verin. Bu süre, dengeleme tekrarlanabilir spektrumları elde etmek için esastır. Sistem dengelenmiş olduğundan emin olmak için, dengeleme döneminde değişecek TIC izlemek isteyen ve daha sonra stabilize olabilir.
4. Sistem dengelenmiş sonra, spektrum toplama başlatın.
5. Spektrum toplandıktan sonra, ilk örnek vanaları kapatarak, taşıyıcı gaz by-pass hattı açılması, ve son olarak da örnek şişesini çıkarırken, numune şişesi çıkarın. Nakil hatları, nem ve uçucu adsorbe kaldırarak örnek-örnek taşınmasını önlemek, sistem 4 dakika - 2 taşıyıcı gaz ile yıkayın.
6. Aralıklı kapsamlı boş çıkarma sağlamak için ek boş spektrumları toplama adımları 5.2 - 5.5, her bir bakteriyel örnek için tekrarlayın. Eksik boş çıkarma yol açacaktıratmosferik basınç iyonizasyon teknikleri yaygın işlenen spektrum kimyasal arka plan doruklarına görünümünü (örneğin, ftalatlar, silikon, vb.) ⁹
7. Spektrumları toplarken, iyon sinyalleri TIC ve bireysel zirvelerinden maksimum yoğunluğu tarafından belirlenir Cihazınızın doğrusal algılama sınırları, geçmeyen olduğunu emin olun. Cihazınızın dedektör üst sınırlamaları aşmaktan İyonlar örnek temsilcisi değildir artifakı doruklarına üretebilirsiniz.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Sesi-MS spektrumları bir örnek olarak, bakteri uçucuların, E. için pozitif iyon modu uçucu parmak izi elde edilebilir coli ve P. 37 C'de 24 saat aerobik LB-Lennox yetiştirilen aeruginosa ° C gösterilmiştir (Şekil 2). E. coli uçucu spektrum m / z = 118 indol hakim olduğu, E. verir coli kültürleri oysa P. spektrum karakteristik koku, aeruginosa protonatable zirveleri daha büyük bir çeşitlilik içerir.

Bölüm 3 açıklanan enstrümantal parametreler üzerine uçucu spektrumunda piklerin bağıl şiddetleri bağlı olduğunu unutmayınız. Bu parametreler deneyinin deney tekrarlanabilir spektrumları elde etmek için sıkı kontrol edilmelidir.

Şekil 2 Boş çıkarılır pozitif iyon modu Sesi-MS spektrumları E. (20 - 150 m / z). coli K12 ve P. 37 LB-Lennox 24 saat aerobik büyüme sonra aeruginosa PAO1 uçucu ° C Sesi spektrumları gözlenen doruklarına hakkında daha fazla bilgi için, Zhu ve ark. ⁸ bakın lütfen.

Bakteriler uçucuların farklı kombinasyonlar, üreten bakteri tanımlama ^10-12 ve metabolik durumunun değerlendirilmesi için kullanılabilir. Sesi-MS yöntemi burada açıklanan bir bakteri türlerinin belirlenmesi için "parmak izi" hızla üreten, herhangi bir numune hazırlama olmadan bakteriyel Uçucu (iki dakika veya daha az) karakterize bir yol sağlar. Son birkaç on yıl ^içinde 8 diğer atmosferik basınç iyonizasyon MS teknikleri seçici iyon akışını tüp (SIFT) ve proton transferi reaksiyonu (PTR) kütle spektrometresi gibi uçucu, karakterizasyonu yapılmıştır. Sesi bu iyonizasyon yöntemlerine göre sağladığı belirgin avantajı bileşik tanımlanması için önemli bir araçtır parçası özel zirveleri (sesi için adapte edilmiştir kütle spektrometresi uygun tip), mümkün olmasıdır. Biz yukarıda sıralanan protokol tepe parçalanma adresi, ama parçalanma bilgi bakteriyel Uçucu karakterizasyonu nasıl kullanılabileceğini örnekler ve diğerleri, Zhu için lütfen vermedi. ⁸

Sesi-MS nefes analizi ile bakteriyel akciğer enfeksiyonları yerinde tespiti için doğrudan bir uygulaması vardır, ancak uçucu örnekleme mümkün olduğu herhangi bir ayar için de uygulanabilir . Örneğin, analiz, metabolik bozukluklar tanısı ile ilgili, idrar, kan, ve nefes uçucu,, GASTROENTERİK hastalığı, kanser ve çevresel maruziyet, Sesi-MS için de ^uygundur. 13,14 Sesi- MS de gıdaların hızlı analizi de dahil olmak üzere, olgunlaşma, yaşlanma ya da bozulmadan ile ilişkili karakteristik uçucu olmayan klinik VOC parmak izi uygulamaları, geniş bir ^yelpazede. 15-18

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışma NIH Hibe P20 RR021905-01, CF RPD hibe STANTO07R0, ve NASA hibe NNH09ZNE002C tarafından finanse edilmektedir.

1. Fuerstenau, S., Kiselev, P. & Fenn, J. B. ESI-MS in the analysis of trace species in gases, in: Proceedings of the 47th ASMS Conference on Mass Spectrometry Allied Topics, Dallas, TX (1999).
2. Wu, C., Siems, W. F. & Hill, H. H. Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs. Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).
3. Tam, M. & Hill, H. H. Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection. Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).
4. Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M. & de la Mora, J. F. Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).
5. Martinez-Lozano, P. & de la Mora, J. F. On-line detection of human skin vapors. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).
6. Martinez-Lozano, P. & de la Mora, J. F. Electrospray ionization of volatiles in breath. Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).
7. Martinez-Lozano, P. & de la Mora, J. F. Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry. Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008)
8. Zhu, J., Bean, H. D., Kuo, Y.-M. & Hill, J. E. Fast detection of volatile organic compounds from bacterial cultures by SESI-MS. J. Clin. Microbiol. 48, 4426-4431 (2010).
9. Guo, X. H., Bruins, A. P. & Covey, T. R. Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).
10. Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A. & Johnson, B. Pathogen detection using headspace analysis. Department of the Air Force, Nov 15, 2004, 16 pp.
11. Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M. & Rieder, J. Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study. Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).
12. Schulz, S. & Dickschat, J. S. Bacterial volatiles: The smell of small organisms. Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).
13. Ligor, T. Analytical methods for breath investigation. Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).
14. Cao, W. Q. & Duan, Y. X. Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment. Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).
15. Law, W. S. et al. Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).
16. Wu, Z. et al. Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).
17. Fleming-Jones, M. E. & Smith, R. E. Volatile organic compounds in foods: A five year study. J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).
18. Calkins, C. R. & Hodgen, J. M. A fresh look at meat flavor. Meat Sci. 77, 63-80 (2007).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.