使用辅助电喷雾质谱（SESI - MS）表征细菌挥发

Bean, H. D., Zhu, J., Hill, J. E. Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS). J. Vis. Exp. (52), e2664, doi:10.3791/2664 (2011).

二次电喷雾电离质谱（SESI - MS），开​​发快速检测挥发性化合物的方法，而不需要样品预处理，一个。该方法最初是由芬恩和他的同事^1，并已应用于检测非法毒品和^爆炸物 3-4，皮肤挥发^物 5的特性，并^分析呼吸6-7。

SESI发生电离电的解决方案和挥发性待测之间的质子转移反应，因此适合杂有机分子的分析，就像在传统的电喷雾电离（ESI）。不过，与标准ESI，SESI质子转移过程发生在气相中的解决方案，而不是（图1），因此SESI最好是适合用于检测有机挥发物和气溶胶。

我们正在扩大使用SESI - MS检测细菌挥发物作为细菌的鉴定和^表征 8方法。我们已经证明，SESI - MS挥发的指纹，与统计分析方法相结合，可以用来区分在生长介质的各种细菌属，种和混合文化，在这里，我们提供获得细菌使用SESI挥发指纹的步骤 - MS，包括应该优化，以​​确保强大的细菌的鉴定和表征的仪器参数。

图1。SESI - MS细菌挥发物的分析原理。到SESI反应室（2）细菌培养的顶空的_{CO 2（1）}流离失所。由于挥发物遍历他们通过电云通SESI反应室，并成为离子（3）。一旦离子，挥发性物质进行分析的质谱仪（4）拉进。多余的载气和未反应的细菌挥发物0.22微米过滤器（5）通过，作为额外的保护措施，排放到一个化学罩。插图：SESI电针是一种石英毛细管用削尖的针尖（40微米ID）。

作为SESI - MS使用示范细菌挥发物， 大肠杆菌的表征大肠杆菌 K12和P.有氧假单胞菌 PAO1培养于50 mL LB -伦诺克斯24小时在37 ° C和顶空挥发物SESI - MS谱是在2分钟内收集。二氧化碳在2 L / min的流速（99.99％）用作载气挥发反应室提供。 SESI反应室的建造和安装一个API - 3000（SCIEX公司），取代了原有的电喷雾离子源是自定义。光谱收集使用0.1％甲酸，5.0％甲醇，和94.9％的水，电的解决方案（V / V）正离子模式，交付5 NL / S通过非导电硅胶毛细管用削尖的针尖（40微米ID）。外加电压为2.5千伏。分析师1.4.2软件（Applied Biosystems公司）是用于数据收集与下列参数：20 - 500大，MCA模式，40扫描，3秒/扫描，总的分析时间和2分钟。

1。培养系统

1. 选择适当的船只越来越多的文化，在你的实验（例如，通风，光线，温度等），以及质谱仪挥发性物质的效率考虑物种的生长要求。我们选择使用的培养瓶100毫升标准配备了至少有两个螺口的螺纹盖的耐热媒体瓶。通过一个入口的行插入一个载气运送到样瓶和插座线是通过仪器提供的挥发性有机化合物（图1）的另外一个端口插入露儿端口。任何额外的端口堵塞。
2. 培养的样品之前，加压船只和淹没在水中，检查有无泄漏。煤气泄漏是非典型薄弱或不存在的离子信号波动的形式结果的主要原因。

2。生物实验：设置和安全方面的考虑

1. 发展适合你的假设条件的文化。这是建议，至少有两个生物的复制，每个有两个技术复制，用于为每个变量。
2. 准备一个空白，为每一种文化条件（培养基，抗生素等），并根据您的样品相同的条件下孵化的空白。
3. 聘请适合您使用的是生物制剂，考虑到物种的生物安全水平（S）的安全防范措施。
4. 为了防止污染仪器的和可行的生物制剂的气体传输线，安装到载气行适当孔径的过滤器。过滤器会不会干扰的挥发物转移到SESI反应室，但可能会稍微影响气溶胶传输效率^6。
5. 使用辅助遏制或生物安全柜时，附加气调第您的培养瓶中，在溢出生物制剂的情况下，以保证正确的遏制。
6. 载气流量的方式，将瓶内的压力无法建立启动和终止样瓶。

3。仪器优化

注：SESI - MS是专门设计的样品挥发物，所以限制使用仪器前香个人护理用品（例如，古龙水，漱口水，乳液，衣物柔顺剂），口香糖，香烟等的使用。紧紧地盖在实验室中所有挥发性化学物质，并在测试过程中尽可能地控制空气的草稿。

以下的仪器参数，这些都影响信号强度和稳定性，将需要为您的仪器和实验进行了优化。

1. 类分子要定位电的解决方案和流速：选择适当的电解决方案，考虑到操作仪器的极性（积极或消极的离子模式）和目标化合物的分子性质。在这个实验中的电液是5.0％，0.1％甲酸，甲醇，94.9％的水（V / V），从而提高信号强度弱极性分子whilË提供良好的信号稳定性。解决的办法是发表在5 NL / s的流量
2. 载气流量：载气流量可能会影响电稳定性和信号强度。这里使用的CO _{2（≥99.99％）}在2 L / min的流速。
3. 针形状和位置：针尖形状和位置的强烈影响信号强度和稳定性。当安装一个新的针，针的位置，必须进行优化，以创建一个低的背景下，高分析物信号强度和信号稳定之间的平衡。为了重现SESI针更改后的光谱，这是必要的定期收集光谱您调整针的位置，直到你能到您的记录相匹配的观测谱。质谱孔口从电针尖的距离将是1 - 5毫米。
4. 外加电压：应用系统的电压会影响信号的离子强度和电Taylor锥稳定性。此外，最佳电压取决于你的电的解决方案和针尖形状。开始在你的一系列实验，确定最佳的频谱和信号稳定，产量为您的系统电压，然后所有后续的实验中使用的电压。对于我们的系统，适用于电压为2.0 - 5.0千伏提供最佳的信号强度和电稳定。在这个实验中使用2.5千伏。

4。打开和调整SESI - MS分析

1. 首先确保电源电压关闭，该系统是电力出院。 1）确保电源电压指示灯熄灭，2）确保万用表上的电压为零，和3）接地的电气信息。
2. 安装适当的电解决方案，为您的实验。
3. 打开载气，并设定流量率适合你的实验。
4. 施加压力，以电水库启动电的解决方案交付的反应室。
5. 打开电源电压和电压调整到一个适当的值，为您的实验。

注意：此时离子源的金属表面，能够提供一个危险的冲击。周围的仪器工作时，一旦供电电压已打开，演习非常谨慎。

6. 设置一个监测SESI - MS谱，而微调的调整施加电压的调整方法。使用的收购，你有你的系统和你的实验优化参数。清除多通道采集（MCA）“复选框（如果适用），每次扫描，产生一个独立的频谱，设置采集时间为10 - 15分钟，并开始收购。现在应该观察到载气的背景光谱。
7. 施加电压进行微调，调整，以获得稳定的总离子流色谱图（TIC），重现性好扫描相匹配_的 CO 2为您以前的实验中扫描。一旦电压作了调整，继续收集5分钟，以确保仪器稳定的光谱和议会。
8. 一旦器乐稳定是保证，建立了适合于您的样品采集方法，调整的采集时间，数据的范围，和马华选择需要。收集记录的载体气体背景光谱。

5。获取您的细菌培养的挥发性指纹

1. 为了收集一个空白频谱，直接通过旁路线的载气流量，并再附上空白​​样品（阀关闭）仪器的气体传输线。
2. 取样瓶，打开阀门，并关闭旁通线的阀。
3. 允许系统平衡为30秒，在这期间，在反应室中的湿度稳定。这一时期的平衡是获得重复性光谱的关键。为了确保该系统是平衡的，你不妨监察旅游业议会，这将改变在平衡期，稳定以后。
4. 一旦该系统是平衡的，启动频谱集合。
5. 频谱是收集后，首先开放的载气旁路线，然后关闭样品阀，并最后消除样品瓶中删除的取样瓶。嵌入式系统与载气为2 - 4分钟，除去从传输线的吸附水分和挥发物，防止样品，样品残留。
6. 重复步骤5.2 - 5.5每个细菌样本，间歇性地收取额外的空白光谱，以确保彻底空白减法。不完整的空白减法将导致在你处理的频谱化学背景山峰，是常见的大气压电离技术，外观（例如，邻苯二甲酸盐，有机硅，等^）9 。
7. 收集您的光谱时，确保离子信号不超过线性检测仪器的限制，由议会和个别峰的最大强度确定。离子超过仪器的检测器上的限制，可以生成神器峰并不代表你的样品。

6。代表性的成果

作为SESI - MS谱的例子可为细菌性挥发物，正离子模式E.挥发指纹大肠杆菌和P.增长有氧24小时假单胞菌在LB -伦诺克斯在37 ° C时（图2）所示。的大肠杆菌大肠杆菌挥发频谱是由吲哚在m / z = 118为主，这给大肠杆菌大肠杆菌文化而P 的频谱特征的气味， 假单胞菌包含的protonatable峰较大的品种。

请注意，在动荡的光谱峰的相对强度取决于在第3节中所述的仪器参数。这些参数必须严格控制的实验，实验，以获得重复性光谱。

图2空白-减去正离子模式SESI - MS谱（20 - 150米/ Z）。 大肠杆菌大肠杆菌 K12和P.假单胞菌 PAO1挥发物LB -伦诺克斯有氧增长24 h后在37 ° C。 SESI光谱中观察到的峰的更多细节， ^请参阅朱等8。

细菌产生的挥发物的不同组合，可^利用 10-12细菌鉴定及代谢状况的评估。这里描述SESI - MS法提供了一种快速定性没有任何样品制备细菌挥发物（在两分钟或更少），产生细菌的“指纹”鉴定的品种在过去的几十年^的其他⁸个大气压电离手段。 MS技术已应用于挥发性化合物的特性，包括选择性离子流管（SIFT）和质子转移反应质谱（PTR）。 SESI这些等离子的方法提供的独特优势在于，它是可能的特定片段峰（提供适当类型的质谱仪，已被改编为SESI），这是一个化合物鉴定的重要工具。我们没有解决在上面列出的协议的高峰碎片，但如何可用于细菌挥发物的定性碎片信息的例子，请参阅 ^朱 ，等。8

SESI - MS直接应用在原位检测细菌性肺部感染，通过呼吸分析，但也可以适用于任何设置挥发采样。例如，挥发物在尿液，血液，呼吸，这是相关的代谢紊乱的诊断分析，胃肠道疾病，癌症和环境接触，是非常适合SESI - ^MS 13,14 SESI - MS也有广泛的非临床VOC指纹识别应用程序，包括食品与成熟，老化，或破坏相关的特征挥发物的快速^分析 15-18 。

没有利益冲突的声明。

这项工作是由美国国立卫生研究院授予RR021905 P20 - 01，CF RPD授予STANTO07R0，以及美国航空航天局授予NNH09ZNE002C。

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