二次エレクトロスプレーイオン化質量分析法（SESI - MS）を用いて細菌揮発性物質の特性評価

Bean, H. D., Zhu, J., Hill, J. E. Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS). J. Vis. Exp. (52), e2664, doi:10.3791/2664 (2011).

二次エレクトロスプレーイオン化質量分析法（SESI - MS）は、サンプルの前処理を必要とせずに、揮発性化合物の迅速な検出のために開発された手法です。メソッドが最初にフェンと同僚¹で記述されていたと違法薬物²と爆薬^3-4、皮膚の揮発性物質⁵の特性評価、および呼吸^6-7の分析の検出に適用されている。

SESIのイオン化はエレクトロスプレー液と揮発性の分析対象物との間のプロトン移動反応によって発生する、と同じように、従来のエレクトロスプレーイオン化（ESI）で、したがって、ヘテロ有機分子の分析に適しています。しかし、標準のESIとは異なり、SESIのプロトン移動のプロセスは、気相ではなく、溶液中で発生します（図1）、したがって、SESIは、最高の有機揮発性物質やエアロゾルの検出に適しています。

私たちは、細菌の同定とキャラクタリゼーション⁸の方法として、細菌の揮発性物質の検出にSESI - MSの使用を拡大しています。我々は、統計的分析法と組み合わせたSESI - MS揮発性のフィンガープリントが、、成長の様々なメディアで細菌属、種、および混合培養を区別するために使用できることを実証した。ここで^8は、我々はSESIを使用して細菌の揮発性のフィンガープリントを取得するための手順を提供する堅牢な細菌の同定と特性評価を保証するために最適化すべき機器パラメータを含めて - MS、。

図1。細菌の揮発性物質のSESI - MS分析のための回路図。細菌培養のヘッドスペースはSESIの反応室（2）にCO _2（1）で変位される。揮発性SESIの反応室を通過する際に、彼らは、エレクトロスプレー雲を通過し、（3）イオン化となる。一回電離した、揮発性物質分析用質量分析計（4）に引っ張られている。過剰キャリアガスと未反応の細菌の揮発性物質は追加の保護措置として、0.22μmのフィルター（5）を通過し、化学フードに通気されています。挿入図：SESIのエレクトロスプレーニードルは、尖った針の先端のキャピラリーシリカ（40μmのID）です。

細菌の揮発性物質の特性評価のためのSESI - MSの使用、E.のデモンストレーションとして大腸菌 K12およびP.緑膿菌 PAO1、37で50 mLのLB -レノックスで24時間好気的に培養されています° Cおよびヘッドスペースの揮発性物質のSESI - MSスペクトルは、2分間に収集されます。 2 L /分の流量で炭酸ガス（99.99％）を反応槽への揮発性の配信のためのキャリアガスとして使用されます。 SESIの反応室は、カスタムいました構築され、オリジナルのエレクトロスプレーイオン源を置き換えるAPI - 3000（SCIEX）に装着。スペクトルは、0.1％ギ酸、5.0％のメタノール、およびエレクトロスプレー液として94.9パーセントの水（v / v）を使用して、正イオンモードで収集5時に配信される尖った針の先端のキャピラリー非導電性シリカを介しNL /秒（40μmのID）。印加電圧は2.5 kVのです。 - 500ダ、MCAモード、40スキャン、3秒/スキャン、および2分、総分析時間は20：アナリスト1.4.2ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社）は、次のパラメータを使用してデータ収集に使用されます。

1。培養システム

1. あなたの実験（例えば、曝気、光、温度、等）だけでなく、質量分析計への揮発性物質の効率的な配信の種の成長要件を考慮し、自分の文化を成長させるための適切な容器を選択してください。我々が使用することを選択培養ボトルには、少なくとも2つのルアーのポートを持っているネジキャップを装備した標準的な100mlのパイレックスメディアのボトルです。サンプル瓶及び出口ラインにキャリアガスの配信用のルアーポートは機器へのVOCの配信のための別のポート（図1）を介して挿入さを通して入口ラインが挿入されます。追加のポートを塞いであります。
2. 培養サンプルを作成する前に、リークをチェックするために水の容器と水没を加圧する。ガス漏れは弱いか存在しない揮発性のイオン信号の形で非定型的な結果の主な原因となっています。

2。生物学的実験：セットアップおよび安全性の考慮

1. あなたの仮説に適切な条件で培養を成長する。それは少なくとも2つの生物学的には、各2との技術が複製、複製の各変数のために使用されることをお勧めします。
2. すべての培養条件のためにブランクを準備（培地、抗生物質、等）と試料と同じ条件で空白をインキュベートする。
3. 考慮種のバイオセーフティレベル（複数可）を服用、使用している生物学的エージェントのための適切な安全上の予防措置を採用しています。
4. 楽器と実行可能な生物剤を用いたガストランスファーラインの汚染を防止するために、キャリアガスラインに適切な孔径のフィルターをインストールします。フィルタは、SESIの反応室への揮発性物質の移転を妨げることはありませんが、少しエアロゾル転送の効率が低下する場合があります^。6
5. 生物剤をこぼしの場合に適切な封じ込めを確実にするために、培養瓶にガスの転送キャップを取り付け、二次封じ込めまたは生物学的安全キャビネットを使用してください。
6. ボトル内の圧力をビルドしないようにしてサンプルのボトルへのキャリアガスの流量を開始および終了。

3。楽器の最適化

注記：SESI - MSは、特にサンプルの揮発するように設計されているので、楽器を使用する前に、香りのパーソナルケア商品（例えば、コロン、マウスウォッシュ、ローション、柔軟仕上げ剤）、ガム、タバコ、等の使用を制限する。しっかりとラボ内のすべての揮発性化学物質をふた、および制御の空気は、テスト中に可能な限りドラフト。

すべての信号強度と安定性に影響を与える次の機器パラメータは、、、測定器、実験用に最適化する必要があります。

1. エレクトロソリューションと流量：アカウントにオペレーティング計器の極性（正または負イオンモード）と、ターゲット化合物の分子の文字を取って、ターゲットにしたい分子のクラスのための適切なエレクトロソリューションを選択してください。この実験では、エレクトロスプレーソリューションは、0.1％ギ酸、5.0％メタノール、極性の小さい分子の信号強度を高める94.9パーセントの水（v / v）を、であるウコン優れた信号安定性を提供する電子。溶液を5 NL / sの流量で配信されます
2. キャリアガス流量：キャリヤーガスの流量は、エレクトロスプレーの安定性とシグナル強度に影響を与えることができる。 2 L /分の流量でCO _{2（≥99.99％）}ここで使用されています。
3. 針の形状と位置：針先の形状と位置は強く信号強度と安定性に影響を与えます。新しいニードルを取り付けるときは、針の位置が低いバックグラウンド、高い分析対象成分の信号強度、および信号の安定性のバランスを作成するために最適化する必要があります。針の変更後にSESIのスペクトルを再現するために、それはあなたのレコードに観測されたスペクトルを一致させることになるまでは、針の位置を調整すると、定期的にスペクトルを収集する必要があります。 5ミリメートル - エレクトロスプレーニードルの先端から大量のスペックのオリフィスまでの距離は1になります。
4. 印加電圧：システムに印加される電圧は、信号のイオン強度とエレクトロテイラーコーンの安定性に影響を与える。さらに、最適な電圧は、エレクトロソリューションと針の先端形状に依存しています。実験のあなたの一連の開始時に、システムに最適なスペクトラムと信号の安定性が得られる電圧を決定し、後続のすべての実験ではこの電圧を使用してください。私たちのシステムの場合は、2.0の印加電圧 - 5.0 kVのは、最適な信号強度とエレクトロスプレーの安定性を提供しています。この実験では2.5 KVが使用されます。

4。電源をオンにすると分析のためのSESI - MSのチューニング

1. 電圧電源がオフになっていることと、システムが静電気を放電していることを確認することから始めます。電圧電源のインジケータライトがゼロのマルチメータで電圧を確保する）、2オフになっている、3）電気リードを接地の確保）1でこれを行います。
2. テスト用の適切なエレクトロソリューションをインストールします。
3. キャリアガスをオンにして、テスト用の適切な速度にフローを設定します。
4. 反応室へエレクトロソリューションの提供を開始するためにエレクトロスプレータンクに圧力を適用する。
5. 電圧、電源をオンにして、実験のための適切な値に電圧を調整する。

注：この時点で、イオン化源の金属表面には、危険な衝撃を提供することができます。電圧、電源がオンされた後に計器の周囲で作業する場合は十分気を付ける。

6. 印加電圧に微調整し、調整する際のSESI - MSスペクトルを監視するためのチューニング方法を設定します。お使いのシステムや実験に最適化した収集パラメータを使用してください。 15分、および収集を開始 - すべてのスキャンが独立したスペクトル、10に収集時間を設定が生成されないようにすること（該当する場合）複数チャンネル集録（MCA）]チェックボックスをオフにします。キャリアガスのバックグラウンドのスペクトルを観察できるはずです。
7. 以前の実験のためのCO ₂のスキャンを一致させる安定したトータルイオンクロマトグラム（TIC）と再現性のスキャンを取得するために印加電圧の微調整の調整を行います。電圧の調整を行った後、機器が安​​定していることを確認するために5分間のスペクトルとTICの収集を継続します。
8. 一度楽器の安定性が確保され、必要に応じて収集時間、データ範囲、およびMCAの選択を調整し、あなたのサンプルに応じて取得方法を設定します。あなたの記録のためのキャリアガスのバックグラウンドのスペクトルを収集する。

5。あなたの細菌培養物の揮発性のフィンガープリントを取得

1. ブランクのスペクトルを収集するには、バイパス線を介してキャリアガスの流れを指示し、楽器のガスの転送ラインに（バルブ閉）ブランクサンプルを添付。
2. サンプルボトルにバルブを開いて、バイパスラインのバルブを閉じてください。
3. システムは、反応室内の湿度が安定している時に、30秒間平衡させる。平衡のこの期間は、再現可能なスペクトルを得るために不可欠です。システムが平衡であることを確認するには、平衡期間中に変更されるTICを、監視したい、そして、その後安定化することがあります。
4. システムが平衡になると、スペクトルの収集を開始。
5. スペクトルが収集された後、最初のサンプルバルブを閉じ、そして最後に、サンプル瓶を除去し、キャリアガスのバイパスラインを開いて、サンプルのボトルを取り外します。 、トランスファーラインから水分と吸着揮発性物質を除去するサンプル間のキャリーオーバーを防止する、4分 - 2のキャリアガスを使用してシステムをフラッシュします。
6. 断続的に徹底したブランク減算を確保するために追加のブランクのスペクトルを収集し、それぞれの細菌サンプルに対して5.5 - 手順5.2を繰り返します。不完全なブランク減算がにつながる大気圧イオン化法に共通して処理されたスペクトルにおける化学物質のバックグラウンドピークの出現、（例えば、フタル酸エステル類、シリコーン類、等^）9。
7. あなたのスペクトルを収集する場合、イオンの信号がとしてTICと個々のピークの最大強度で決定される楽器の線形検出限界を、超えていないことを確認してください。ご使用の機器の検出器の上側の限界を超えるイオンは、サンプルの代表ではないアーティファクトのピークを生成することができます。

6。代表的な結果

細菌の揮発性物質、E.のためのポジティブイオンモード揮発性の指紋を得ることができるSESI - MSスペクトルの例として大腸菌とP.緑膿菌は、° C（図2）に示されている37℃で24時間LB -レノックスで好気的に成長した。 E.大腸菌揮発性スペクトルはE.を与える、のm / z = 118でインドールによって支配されているP.のスペクトルに対し、彼らの特異臭、 大腸菌の培養緑膿菌にはプロトンのピークの種類が多くなりが含まれています。

揮発性スペクトルのピークの相対強度は、3章で説明されている機器パラメータに依存していることに注意してください。これらのパラメータは、しっかりと再現性のスペクトルを得るために実験間に制御する必要があります。

E.の。 - 図2ブランクを差し引いた正イオンモードSESI - MSスペクトル（150のm / z 20） 大腸菌 K12およびP. 37 LB -レノックスで24時間好気生育℃の後の緑膿菌 PAO1揮発性物質をSESIスペクトルで観測されたピークの詳細については、朱、 ら⁸を参照してください。

細菌は、細菌の同定^10月12日と代謝状態の評価に利用することができる揮発性物質のさまざまな組み合わせを、作り出す。 SESI - MS法では、急速に種の同定のための細菌の"指紋"を生成し、任意のサンプル準備もなしに細菌の揮発性物質を（2分以内で）を特徴付けるための手段を提供するここで説明する。過去数十年で他の⁸大気圧イオン化は、 MSの技術は、選択的なイオンのフローチューブ（SIFT）とプロトン移動反応（PTR）質量分析を含む揮発性化合物の特性評価に適用されている。 SESIは、これらの他のイオン化法を介して提供される独特の利点は、化合物同定のための重要なツールであるフラグメント特定のピーク（SESIに適応されている質量分析装置の適切なタイプを用意）、することが可能であることです。我々は、上記のプロトコルのピークの断片化を取り上げますが、断片化情報が細菌の揮発性物質の特性評価に使用できる方法の例については、 ら 、朱を参照してくださいしていない^8。

SESI - MSは、呼気分析を介して細菌の肺感染症の in situ検出のために直接アプリケーションを持っていますが、揮発性のサンプリングが可能なすべての設定にも適用することができます。例えば、代謝性疾患の診断に関連する尿、血液、及び呼気中揮発性物質の分析は、胃腸疾患、癌、および環境ばく露は、よくSESI - MSに適しています^。13,14 SESI - MSはまた持っている、熟成老化、または台無しに関連付けられている特徴的な揮発性物質のための食品の迅速な分析を含めた非臨床VOCフィンガープリントアプリケーション、の広い範囲^{。15から18}

利害の衝突は宣言されません。

この作品は、NIHの助成金P20 RR021905 - 01、CF RPD助成STANTO07R0、と米航空宇宙局（NASA）の助成金NNH09ZNE002Cによって運営されている。

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