荧光光谱法测定膜蛋白质折叠的热力学

1。 〜50 nm的直径小（越野车）Unilamellar囊泡膜蛋白质折叠的制备

1. 1,2 - dimyristoyl - SN -甘油- 3 - phosphocholine（DMPC）在氯仿中血脂的解决方案是购买和aliquotted在20毫克每小瓶数量存储到干净的玻璃小瓶。添加到每一瓶氮气层，以防止脂质过氧化，与瓶盖和封口膜密封小瓶。小瓶存放在-20℃冷冻，直到使用。
2. 一个包含20毫克脂质在氯仿分装的单瓶是用于每个实验。小瓶的内容使用1小时，直到无溶剂残留的氮气流干。
3. 干血脂悬浮于1毫升20 mM磷酸钾缓冲液（pH值= 7.3）使用水浴sonicator为〜30秒。这种暂停脂质的解决方案会出现阴天，是一个圆锥形的底部转移至15毫升塑料管。添加到另一个磷酸盐缓冲液1毫升等分，原本载脂的空玻璃瓶，和超声是重复的解决方案，然后添加到相同的15毫升管。重复此过程，共4次，直到最后管量为4毫升，导致血脂浓度在5毫克/毫升在这股囊泡解决方案。
4. 脂质囊泡溶液4毫升的量是摆在一个温暖的（〜30 ° C）水浴和超声占空比为50％，使用1小时ultrasonicator微尖。水浴的目的是双重的。首先，它可以防止由于超声过程变得太热脂质的解决方案。其次，温水浴，确保水脂解温度仍然在超声双层相转变温度以上; DMPC，这一转变温度为〜23 ° C。
5. 超声解决方案是通过孔径为0.22μm注射器过滤器删除从sonicator尖端的碎片，这个过滤解决方案是平衡的，在37℃过夜° C。

2。初始荧光展开曲线的样品制备

1. 是由一个20毫米的磷酸盐缓冲液（pH值7.3）10 M尿素原液。重要的是，水被添加到固体（反之亦然），因为大量的尿素在解决方案中占有显着的体积。此尿素溶液，可溶质加入到一个干净的，空瓶子，并加水，达到了预期的最终体积。这个解决方案可能需要水浴中搅拌溶解的溶质的一个热点板块升温。尿素是吸湿的，因此，实际尿素原液的浓度应确定使用折射率。
2. 一个股票缓冲液20 mM磷酸盐（pH值7.3）。
3. A股解决方案展开蛋白准备。 8 M尿素，20毫米的磷酸盐缓冲液中，这股蛋白质的解决方案应该有一个〜200微米蛋白的浓度。
4. 在下列方式中的荧光研究的样品准备。股票蛋白的相应卷（2.3节），股票脂解（5毫克/毫升的脂质，第1条），股票10米的尿素溶液（2.1节），和股票磷酸盐缓冲液（2.2节）相结合，使样品中含有〜4 μM蛋白质，1毫克/毫升的血脂，0到1米递增8 M尿素。每个样品的总体积为200μL。包括一个例子试算表（表1）列出卷需要使用200微米的股票蛋白质溶液。
5. 空白样品如在2.4节中所述，然而，蛋白质是不添加。在蛋白质的地方，可能会增加18米的尿素溶液4μL，使其他组件的浓度在2.4节相同的。这些空白减去散射和荧光光谱在蛋白质中出现的其他背景信号。
6. 从第2.4和2.5的样品可以在37 ° C孵育荧光光谱测量前至少2个小时，以确保完成折叠和平衡。

3。荧光光谱的测量

每个样品和空白的色氨酸荧光测量采用稳态荧光。应记录激发波长290纳米的荧光光谱，以避免激发酪氨酸残基，并从305到500纳米扫描。典型的入口和出口带通为3纳米。波长增量和积分时间，可以优化信号信噪比。波长增量和集成时间的典型值是1海里/步骤和0.5秒/步，分别的。膜蛋白折叠成合成脂类，只有当温度高于双层相变温度。因此，在这种情况下DMPC与，样品的温度恒定在30 ° C。在这些前利用一个微量熔融石英160μL的能力比色皿periments。

4。新一代的初步展开曲线和吉布斯自由能展开蛋白膜的估算

1. 荧光光谱在一个XY数据集的形式装入伊戈尔临，MATLAB，原产地或Excel等软件。
2. 必须减去从尿素和脂质囊泡的背景信号，使用下列程序：
   频谱=蛋白原料的荧光光谱中存在的脂质囊泡和特定浓度的尿素。
   频谱乙=原料相应的空白样品的荧光光谱包含脂质囊泡和相同的尿素浓度，在频谱;没有在空白样品的蛋白质。
   更正频谱=频谱A - C *频谱B. C是一个标量通常等于1.0。在某些情况下，C是小于或大于1.0，因为散射造成过度的问题，或减〜305-320 nm区域附近。
3. 最大荧光的波长_，λ最大，载列从纠正每个尿素浓度的光谱。一个典型的价值为充分展开，而折叠的蛋白质〜330 nm的膜蛋白是350纳米。表格的波长转换为分数展开转换λ _最大值 （〜330〜350纳米）范围内的范围从0.0到1.0关联_λ最大值展开人口的一小部分。例如，一个λ330 nm处_的最大价值对应为0.0，350 nm的对应到1.0，和340 nm处的对应分数为0.5展开。这种折叠蛋白的一小部分，然后对尿素浓度作图。如上所述，尿素浓度应通过测量折射率的实验来确定。
4. 我们假设，该蛋白可以存在于两种状态之一：折叠或展开。分数情节的展开，F，与尿素浓度，C，可拟合方程^： 2
   
   系数 m对应的自由能的变化率与变性剂浓度_，C M对应的中点折叠人口等于展开人口的尿素浓度。这些值是由最小二乘法拟合得到的数据分析软件的装修变量（0.001987千卡/摩尔•K），R是气体常数，T是温度（303 K）。
5. 从拟合得到的系数是用来确定尿素的情况下展开的Gibbs自由能（kcal / mol的）： 。

5。吉布斯自由能展开更多的精密测量曲线优化展开。

1. 上文所述的展开曲线揭示了尿素浓度的范围，导致在_λ最大的变化最大。这个范围通常很小，这个小范围内开展的大部分发生。为了准确地确定开展的免费能源，额外的样品进行了分析，这一地区获得一个阴谋，它包含许多数据点优化最小二乘法拟合的必要。例如，如果蛋白质在2和4 M尿素之间展开，样本可包含2 - 4米增量为0.2 M尿素，以更准确地揭示这一重要地区的展开曲线的形状。这是没有必要在每个尿素浓度来衡量的空白光谱，它是足以衡量一个空白频谱每〜0.5 M步。
2. 从原始的展开曲线获得从这个情节的展开自由能获得可能略有不同，但反映了一个更精确的的值。

6。代表性的成果：

股票的解决方案，使荧光样品量见表1 。

图1〜5微米的具有代表性的膜蛋白，包含一个单一的色氨酸残基的色氨酸荧光光谱。 （一）原蛋白的荧光光谱（频谱从4.2）;（二）原料空白的荧光光谱（从4.2频谱二），（三）更正4.2频谱。

更正大量的尿素浓度从图1图2。色氨酸膜蛋白的荧光光谱。

图3。展开适合在4.4式，从图2中的数据获得的曲线。吉布斯自由能计算根据4.5节。

目前的协议描述了一代展开膜相关的蛋白质和多肽含有色氨酸残基的曲线。在这里，它是假设，色氨酸荧光反映蛋白质折叠和插入到合成脂质囊泡，或在溶液中展开。额外的假设，如两个国家的折叠和自由能与变性剂浓度的线性关系，在当前的报告;。修改这些假设的结果， ^在不同的方程式2实验协议可以很容易地进行修改，以利用不同的光谱观测，如圆二色性，吸收，或从外在染料的荧光，以及凝胶电泳。此外，不同的变性剂，如阴离子脂质如胍，酸性溶液中，或温度，以及替代血脂/囊泡，大unilamellar水泡，或胶束，可以利用^。5,6最后，该协议可以应用到任何膜蛋白，膜相关肽，和可溶性蛋白/多肽符合标准可逆折叠，并展品光谱或其他不同构象状态的观察到的标记。在可溶性蛋白质的情况下，水疱明显省略的协议。

吉布斯自由能的开展提供了稳定的生物分子的非共价键相互作用的洞察力。在我们的实验室，我们已经测量了外膜蛋白A（OmpA）的突变体，包含单色氨酸残基在不同的地点展开的曲线，并上报到野生型的蛋白质，它包含5个原生的色氨酸残^基突变体不稳定，相对7。辅以其他技术，包括振动光谱，这些展开的研究，阐明分子的细节，例如，氢键和成对的相互作用，在稳定的基础变化。总之，展现曲线的相对简单的技术可以应用到膜和可溶性蛋白的发现与蛋白质折叠有关的热力学。