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 JoVE Bioengineering

झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

,

Chemistry and Biochemistry, University of California San Diego - UCSD

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Cite this Article: झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy. J. Vis. Exp. (50), e2669, doi:10.3791/2669 (2011).

Abstract: झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

झिल्ली प्रोटीन तह दोनों मौलिक और स्वास्थ्य से संबंधित महत्व के साथ एक उभरती विषय है. प्रोटीन के इस सर्वव्यापी परिवार की तह के व्यापक अध्ययन के लिए कोशिकाओं की जरूरत underlies में झिल्ली प्रोटीन की बहुतायत है. इसके अतिरिक्त, हमारे misfolded प्रोटीन के साथ जुड़े रोगों विशेषताएँ करने की क्षमता में अग्रिम प्रोटीन तह के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक और सैद्धांतिक प्रयासों से प्रेरित है. इस महत्वपूर्ण क्षेत्र में रैपिड प्रगति दुर्भाग्य से निहित झिल्ली प्रोटीन और तह तंत्र की जटिलता के साथ जुड़े चुनौतियों द्वारा रुकावट है. यहाँ, हम एक प्रतिनिधि ई. से अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के लिए denaturant, Δ ° जी एच 2 हे के अभाव में खुलासा गिब्स मुक्त ऊर्जा के thermodynamic संपत्ति को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया रूपरेखा कोलाई. इस प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के आवेदन पर ध्यान केंद्रित denaturant एकाग्रता के एक समारोह के रूप में मुड़ा हुआ और सामने आया राज्यों के संतुलन आबादी का निर्धारण. सिंथेटिक लिपिड vesicles के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डेटा विश्लेषण प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम की तैयारी के लिए प्रायोगिक विचारों पर प्रकाश डाला जाता है. इस तकनीक बहुमुखी है और denaturant के तापमान और पीएच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lipids और micelles के विभिन्न तह वातावरण सहित विभिन्न प्रकार, के साथ चलाया जा सकता है है. मौजूदा प्रोटोकॉल है कि किसी भी झिल्ली या घुलनशील प्रोटीन है कि नीचे चर्चा मापदंड के सेट को पूरा करने के लिए सामान्यकृत किया जा सकता है.

Protocol: झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

1. ~ 50 एनएम व्यास लघु Unilamellar vesicles (एसयूवी) की झिल्ली प्रोटीन तह के लिए तैयार

  1. (DMPC) 1,2 - dimyristoyl-SN-glycero-3 - phosphocholine क्लोरोफॉर्म में lipids के समाधान खरीदा है और भंडारण के लिए 20 मिलीग्राम प्रति शीशी मात्रा में स्वच्छ कांच की शीशियों में aliquotted . प्रत्येक शीशी नाइट्रोजन गैस की एक परत जोड़ा है लिपिड ऑक्सीकरण रोकने, और शीशियों कैप और parafilm के साथ सील कर रहे हैं. शीशियों उपयोग करें जब तक एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत हैं.
  2. एक एकल शीशी है कि क्लोरोफॉर्म में 20 मिलीग्राम लिपिड का एक विभाज्य शामिल प्रत्येक प्रयोग के लिए प्रयोग किया जाता है. शीशी की सामग्री कोई विलायक रहता है जब तक एक घंटे के लिए नाइट्रोजन गैस की एक धारा का उपयोग करने के लिए सूख रहे हैं.
  3. सूखे लिपिड 20 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 1 एमएल में resuspended हैं (7.3 = पीएच) ~ 30 सेकंड के लिए एक पानी के स्नान sonicator का उपयोग. निलंबित लिपिड का यह समाधान बादल दिखाई देगा, और एक शंक्वाकार नीचे के साथ एक प्लास्टिक ट्यूब 15 एमएल हस्तांतरित है. एक अन्य फॉस्फेट बफर के 1 एमएल विभाज्य खाली गिलास शीशी कि मूल लिपिड निहित करने के लिए जोड़ा है, और sonication दोहराया है, समाधान तो एक ही ट्यूब 15 - एमएल के लिए जोड़ा जाता है. इस प्रक्रिया में कुल 4 बार दोहराया है जब तक ट्यूब में अंतिम मात्रा 4 एमएल है, 5 इस शेयर पुटिका समाधान में मिलीग्राम / एमएल के एक लिपिड एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप.
  4. 4 लिपिड पुटिका समाधान के एमएल मात्रा में रखा जाता है एक गर्म (30 ~ ° सी) जल स्नान, और 1 घंटे के लिए 50% कर्तव्य चक्र में एक ultrasonicator microtip का उपयोग sonicated. पानी के स्नान के उद्देश्य दुगना है. सबसे पहले, यह sonication प्रक्रिया की वजह से भी गर्म होने से लिपिड समाधान रोकता है. दूसरा, गुनगुने पानी से स्नान सुनिश्चित करता है कि जलीय लिपिड समाधान के तापमान sonication के दौरान bilayer चरण संक्रमण तापमान ऊपर रहता है, DMPC के लिए, इस संक्रमण तापमान 23 डिग्री सेल्सियस ~~
  5. sonicated 0.22 सुक्ष्ममापी sonicator सिरे से मलबा हटाने, और इस फ़िल्टर समाधान equilibrated 37 पर रात में है फिल्टर सिरिंज डिग्री सेल्सियस समाधान के माध्यम से पारित कर दिया है

2. प्रारंभिक प्रतिदीप्ति खुलासा वक्र के लिए नमूना तैयार

  1. 10 एम यूरिया की एक 20 मिमी फॉस्फेट बफर (7.3 पीएच) में शेयर समाधान किया जाता है. यह आवश्यक है कि पानी ठोस (और इसका उल्टा नहीं) जोड़ा जा सकता है क्योंकि यूरिया की बड़ी मात्रा में समाधान में एक महत्वपूर्ण मात्रा में रह रहे हैं. यह यूरिया समाधान एक स्वच्छ, खाली बोतल विलेय जोड़ने और इरादा अंतिम मात्रा करने के लिए पानी जोड़ने के द्वारा बनाया जा सकता है. यह समाधान एक पानी के स्नान में या घुला हुआ पदार्थ भंग की सरगर्मी के साथ एक गर्म थाली पर वार्मिंग की आवश्यकता हो सकती है. यूरिया हीड्रोस्कोपिक है और इसलिए, यूरिया शेयर समाधान के वास्तविक एकाग्रता अपवर्तक सूचकांक का उपयोग करके निर्धारित किया जाना चाहिए 1.
  2. 20 मिमी फॉस्फेट (7.3 पीएच) के एक शेयर बफर समाधान किया जाता है.
  3. एक शेयर के समाधान सामने आया प्रोटीन तैयार है. यह शेयर प्रोटीन समाधान 8 एम यूरिया, 20 मिमी फॉस्फेट बफर में ~ 200 सुक्ष्ममापी प्रोटीन की एकाग्रता होनी चाहिए.
  4. प्रतिदीप्ति अध्ययन के लिए नमूने निम्न तरीके से तैयार हैं. शेयर प्रोटीन की उचित मात्रा (2.3 अनुभाग), शेयर लिपिड (5 मिलीग्राम / एमएल लिपिड, खंड 1) समाधान, शेयर 10 एम यूरिया समाधान (2.1 अनुभाग), और शेयर फॉस्फेट बफर (2.2 अनुभाग) 4 ~ युक्त नमूने बनाने के लिए संयुक्त रहे हैं सुक्ष्ममापी प्रोटीन, 1 मिलीग्राम / एमएल लिपिड, और 0 से 1 एम वेतन वृद्धि में 8 एम यूरिया. प्रत्येक नमूने की कुल मात्रा 200 μL है. एक उदाहरण स्प्रैडशीट (1 टेबल) शामिल है कि सूचियों मात्रा एक 200 सुक्ष्ममापी शेयर प्रोटीन समाधान का उपयोग करने की आवश्यकता है.
  5. खाली नमूने बना रहे हैं जैसा कि खंड 2.4 में वर्णित है, तथापि, प्रोटीन नहीं जोड़ा जाता है. प्रोटीन की जगह में, एक 8 एम यूरिया समाधान के 4 μL ताकि अन्य घटकों की सांद्रता 2.4 खंड में उन लोगों के लिए समान हैं जोड़ा जा सकता है. ये कारतूस के बिखरने और अन्य पृष्ठभूमि संकेत है कि प्रोटीन की प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा में प्रकट होता है घटाना करने के लिए उपयोग किया जाता है.
  6. 2.4 और 2.5 वर्गों से नमूने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए 37 ° C पर प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के माप से पहले पूरी तह और संतुलन सुनिश्चित सेते अनुमति दी जाती है.

3. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के मापन

प्रत्येक नमूना और रिक्त Tryptophan प्रतिदीप्ति एक स्थिर राज्य fluorometer का उपयोग करने के लिए मापा जाता है. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा उत्तेजना 290 एनएम तरंगदैर्ध्य के साथ दर्ज किया जाना चाहिए tyrosine अवशेषों की उत्तेजना से बचने के, और 305 करने के लिए 500 एनएम से स्कैन. विशिष्ट प्रवेश द्वार और बाहर निकलें bandpass 3 एनएम है. तरंग दैर्ध्य वेतन वृद्धि और एकीकरण के समय संकेत से शोर अनुपात के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. तरंगदैर्ध्य वेतन वृद्धि और एकीकरण समय के लिए विशिष्ट मान 1 एनएम / कदम और 0.5 सेकंड कदम / क्रमशः रहे हैं. झिल्ली आम तौर पर सिंथेटिक लिपिड में गुना केवल जब तापमान bilayer चरण संक्रमण तापमान ऊपर है प्रोटीन. इसलिए, DMPC के इस मामले में, नमूना का तापमान 30 में लगातार आयोजित किया जाता है डिग्री सेल्सियस 160 μL क्षमता के साथ एक microvolume जुड़े सिलिका क्युवेट इन पूर्व में उपयोग किया जाता हैperiments.

4. प्रारंभिक खुलासा और गिब्स झिल्ली खुलासा प्रोटीन की नि: शुल्क ऊर्जा की वक्र आकलन के जनरेशन

  1. एक xy डेटासेट के रूप में प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा इगोर प्रो, Matlab, उत्पत्ति, या Excel जैसे सॉफ्टवेयर में लोड कर रहे हैं.
  2. यूरिया और लिपिड पुटिका पृष्ठभूमि से सिग्नल निम्न कार्यविधि का उपयोग subtracted होना चाहिए:
    स्पेक्ट्रम लिपिड vesicles और यूरिया की विशिष्ट एकाग्रता की उपस्थिति में एक = कच्चे प्रोटीन की प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम.
    स्पेक्ट्रम बी = इसी रिक्त नमूने के कच्चे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम है कि लिपिड vesicles और वही यूरिया एकाग्रता शामिल है कि के रूप में स्पेक्ट्रम में एक, कोई रिक्त नमूने में प्रोटीन है.
    सही स्पेक्ट्रम स्पेक्ट्रम = ए - सी * स्पेक्ट्रम बी सी एक अदिश आम तौर पर 1.0 के बराबर है. कुछ मामलों में, सी बिखरने मुद्दों है कि कारण की वजह से कम या 1.0 से अधिक है या अधिक ~ 305-320 एनएम क्षेत्र के निकट - घटाव के तहत.
  3. अधिकतम प्रतिदीप्ति, λ अधिकतम की तरंग दैर्ध्य प्रत्येक यूरिया एकाग्रता के लिए सही स्पेक्ट्रा से सारणीबद्ध है. पूरी तरह के लिए एक विशिष्ट मूल्य सामने आया झिल्ली प्रोटीन 350 एनएम है जबकि जोड़ प्रोटीन की है कि ~ 330 एनएम है. सारणीबद्ध तरंगदैर्य अंश में कनवर्ट कर रहे हैं 0.0 रेंज λ अधिकतम मान (~ ~ 350 एनएम से 330) की श्रेणी परिवर्तित करने के लिए 1.0 λ सामने आया जनसंख्या के अंश के लिए अधिकतम मूल्य सहसंबंधी द्वारा सामने आया. उदाहरण के लिए, 330 एनएम के एक λ अधिकतम मूल्य 0.0 से मेल खाती है है, 350 एनएम 1.0 के लिए मेल खाती है, और 340 एनएम अंश के मामले में 0.5 से मेल खाती है सामने आया है. तब सामने आया प्रोटीन का यह अंश यूरिया एकाग्रता के खिलाफ योजना बनाई है. जैसा ऊपर कहा गया है, यूरिया एकाग्रता अपवर्तक सूचकांक को मापने के द्वारा प्रयोगात्मक निर्धारित करना चाहिए.
  4. हम मानते हैं कि प्रोटीन एक दो राज्यों के में मौजूद कर सकते हैं: जोड़ या सामने आया. अंश की साजिश सामने आया, च, बनाम यूरिया एकाग्रता, सी, समीकरण के लिए फिट हो सकता है : 2
    2 समीकरण
    गुणांक मीटर denaturant एकाग्रता के लिए सम्मान के साथ मुक्त ऊर्जा के परिवर्तन की दर से मेल खाती है है, और सी मीटर मध्य यूरिया एकाग्रता जिस पर जोड़ जनसंख्या सामने आया आबादी के बराबर के लिए मेल खाती है. इन मूल्यों फिटिंग चर डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के द्वारा कम से कम वर्गों की फिटिंग से प्राप्त कर रहे हैं आर (.०,०१,९८७ kcal / mol कश्मीर •) गैस कानून निरंतर है, और टी तापमान ( 303 कश्मीर).
  5. फिट से प्राप्त गुणांकों यूरिया के अभाव में खुलासा गिब्स मुक्त ऊर्जा (किलो कैलोरी / mol) निर्धारित करने के लिए उपयोग कर रहे हैं: 3 समीकरण .

5. गिब्स खुलासा का नि: शुल्क ऊर्जा के अधिक सटीक मापन के लिए वक्र खुलासा अनुकूलित.

  1. खुलासा ऊपर वर्णित वक्र यूरिया सांद्रता की सीमा है कि λ अधिकतम में सबसे बड़ा परिवर्तन का कारण बनता है पता चलता है. इस रेंज आमतौर पर छोटी है, और खुलासा के बहुमत के इस छोटे से सीमा के भीतर होता है. आदेश में ठीक से मुक्त ऊर्जा का खुलासा निर्धारित करने के लिए, अतिरिक्त नमूने इस क्षेत्र में विश्लेषण कर रहे हैं के लिए एक साजिश है कि कई डेटा अनुकूलित फिटिंग कम से कम वर्गों के लिए आवश्यक अंक शामिल प्राप्त हैं. उदाहरण के लिए, यदि प्रोटीन के बीच 2 और 4 एम यूरिया करेंगी, नमूने बनाया जा कि 2 होते हैं - एम यूरिया 4 0.2 एम वेतन वृद्धि में अधिक खुलासा वक्र में इस महत्वपूर्ण क्षेत्र के आकार को ठीक - ठीक पता चलता है. यह प्रत्येक यूरिया एकाग्रता में रिक्त स्पेक्ट्रा को मापने के लिए आवश्यक नहीं है, यह हर ~ 0.5 एम कदम एक खाली स्पेक्ट्रम उपाय करने के लिए पर्याप्त है.
  2. खुलासा की इस साजिश से मुक्त ऊर्जा प्राप्त मूल खुलासा वक्र में प्राप्त से थोड़ा अलग है, लेकिन हो सकता है एक और अधिक सटीक मान को दर्शाता है.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

नमूना अंतिम [यूरिया] एम, शेयर प्रोटीन (μL) शेयर लिपिड (μL) शेयर 10 एम यूरिया (μL) बफर स्टॉक (μL)
1 0.16 ~ 4 40 0 156
2 1 4 40 20 136
3 2 4 40 40 116
4 3 4 40 60 96
5 4 4 40 80 76
6 5 4 40 100 56
7 6 4 40 120 36
8 7 4 40 140 16

तालिका 1 स्टॉक प्रतिदीप्ति नमूने बनाने के लिए आवश्यक समाधान के वॉल्यूम.

चित्रा 1
चित्रा 1. Tryptophan ~ 5 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधि झिल्ली प्रोटीन है कि एक एकल tryptophan अवशेषों के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा. (ए) प्रोटीन के कच्चे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा (स्पेक्ट्रम 4.2 से एक), (बी) रिक्त कच्चा प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा (4.2 से स्पेक्ट्रम बी), (सी) 4.2 से स्पेक्ट्रम सही.

चित्रा 2
चित्रा 2 कई यूरिया सांद्रता के लिए चित्रा 1 से tryptophan प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा झिल्ली प्रोटीन की सही.

चित्रा 3
चित्रा 3 चित्रा 2 में डेटा से 4.4 में समीकरण के लिए फिट के साथ, प्राप्त वक्र खुलासा. . गिब्स मुक्त ऊर्जा 4.5 खंड के अनुसार गणना की है.

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Discussion: झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

वर्तमान प्रोटोकॉल झिल्ली जुड़े प्रोटीन और पेप्टाइड्स कि tryptophan अवशेष होते घटता खुलासा की पीढ़ी का वर्णन करता है. यहाँ, यह माना जाता है कि tryptophan प्रतिदीप्ति को दर्शाता है कि प्रोटीन तह और सिंथेटिक लिपिड vesicles में डाला, या समाधान में सामने आया. दो राज्य तह और denaturant एकाग्रता के साथ मुक्त ऊर्जा के रैखिक निर्भरता जैसे अतिरिक्त मान्यताओं, वर्तमान रिपोर्ट में बना रहे हैं, इन मान्यताओं के परिणामस्वरूप विभिन्न समीकरणों में संशोधन 2 प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल आसानी से करने के लिए विभिन्न स्पेक्ट्रोस्कोपी observables का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जैसे परिपत्र dichroism, अवशोषण, या एक बाह्य डाई से प्रतिदीप्ति, 3 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जेल वैद्युतकणसंचलन के रूप में 4. इसके अतिरिक्त, guanidinium, अम्लीय समाधान, या तापमान, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वैकल्पिक लिपिड / vesicles के रूप में विभिन्न denaturants, anionic lipids जैसे बड़े unilamellar vesicles, या micelles, हो. उपयोग कर सकते हैं 5,6 अंत में, प्रोटोकॉल किसी भी झिल्ली प्रोटीन, झिल्ली जुड़े पेप्टाइड, और घुलनशील प्रोटीन / पेप्टाइड है कि पलटवाँ तह के मानदंडों को पूरा करने के लिए लागू किया जा सकता है, और है कि दर्शाती एक स्पेक्ट्रोस्कोपी या अन्य विभिन्न राज्यों के लिए गठनात्मक नमूदार मार्कर. घुलनशील प्रोटीन के मामले में, vesicles जाहिर प्रोटोकॉल से छोड़े गए हैं.

गिब्स खुलासा के मुक्त ऊर्जा noncovalent कि बातचीत biomolecules स्थिर में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. हमारी प्रयोगशाला में, हम बाहरी झिल्ली प्रोटीन एक (OmpA) की म्यूटेंट है कि विभिन्न स्थानों में एक tryptophan के अवशेष होते हैं के लिए घटता खुलासा मापा है, और ने बताया कि जंगली प्रकार के प्रोटीन है कि पांच देशी tryptophan अवशेषों को समाहित करने के लिए म्यूटेंट रिश्तेदार अस्थिर थे 7. ये खुलासा अध्ययन कंपन स्पेक्ट्रोस्कोपी सहित अन्य तकनीकों, के द्वारा पूरित कर रहे हैं के आणविक विवरण, उदाहरण के लिए, हाइड्रोजन संबंध और जोड़ो में बातचीत है कि स्थिरता में भिन्नता आबाद स्पष्ट है. सारांश में, खुलासा घटता के अपेक्षाकृत सरल तकनीक झिल्ली और घुलनशील प्रोटीन प्रोटीन तह के साथ जुड़े ऊष्मा प्रकट करने के लिए लागू किया जा सकता है.

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Disclosures: झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

हम उसके डेटा का उपयोग करने के लिए बीजिंग वू धन्यवाद. इस काम JEK के लिए एक NSF कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया

Materials: झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

Name Company Catalog Number Comments
DMPC Avanti Polar Lipid, Inc 850345C
Urea MP Biomedicals 04821527
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific P288
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285

References: झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

  1. Shirley, B. A. in Protein Folding and Stability (ed Shirley, B.A.) 177-190 (Humana Press, 1995).
  2. Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
  3. Lau, F. W. & Bowie, J. U. A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein. Biochemistry 36, 5884-5892 (1997).
  4. Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M. & Fleming, K. G. β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro. J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).
  5. Booth, P. J. & Curnow, P. Folding scene investigation:  membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).
  6. Hong, H., Tamm, L. K. Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 101, 4065-4070 (2004).
  7. Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E. & Kim, J. E. Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA. Biochemistry 47, 12844-12852 (2008).

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Posted by: AnonymousNovember 7, 2011, 9:46 AM

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