蛍光分光法により測定膜タンパク質フォールディングの熱力学

1。膜タンパク質のフォールディングのための〜50 nmの直径小さな単層小胞（SUV車）の調製

1. 1,2 -ジミリストイル- sn -グリセロ-3 -ホスホコリン（DMPC）、クロロホルム中脂質の溶液を保存用バイアルの量あたり20 mgで購入し、清浄なガラスバイアルに小分けされています。窒素ガスの層は、脂質の酸化を防ぐために、各バイアルに添加され、そしてバイアルをキャップし、パラフィルムで密封されている。バイアルは使用するまで-20℃の冷凍庫に保存されます。
2. クロロホルムの20 mgの脂質のアリコートを含む単一のバイアルは、各実験に使用されます。バイアルの内容は、無溶剤のままになるまで1時間窒素ガスの流れを用いて乾燥している。
3. 乾燥脂質は、〜30秒間、水浴の超音波処理を用いて20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH = 7.3）1mLに再懸濁する。中断された脂質のこの溶液は濁り表示され、円錐形の底部にプラスチックを15 mLの試験管に移している。リン酸緩衝液の別の1mLのアリコートはもともと脂質が含まれている空のガラス製バイアルに添加され、そして超音波処理が繰り返されます。溶液は、次いで同じ15 mLの試験管に追加されます。チューブの最終容量は、この株式の小胞の溶液中で5 mg / mLの脂質の濃度で、その結果、4 mLのようになるまでこのプロセスを4回の合計が繰り返されます。
4. 脂質ベシクル溶液4 mLのボリュームが置かれている暖かい（〜30℃）の水浴、および50％のデューティサイクルで1時間ultrasonicatorのマイクロチップを使用して超音波処理。水浴の目的は2つあります。最初に、それがために超音波処理プロセスのあまりに高温になることから、脂質溶液を防ぎます。 DMPCのために、この転移温度は〜23℃であり、第二に、温かいお風呂は、水性脂質溶液の温度は超音波処理中に、二重層の相転移温度以上に保つことができます
5. 超音波処理ソリューションは、超音波処理器の先端からゴミを削除するには、0.22μmのシリンジフィルターを通過し、このろ液は37℃で一晩平衡化される℃です。

2。初期蛍光アンフォールディングカーブのための試料調製

1. 20mMリン酸緩衝液（pH7.3）で10 Mの尿素の原液が行われます。それは尿素の大量の溶液中でかなりのボリュームを占有しているので、水が固体（およびその逆）に追加されることが不可欠です。この尿素溶液はきれい、空の瓶に溶質を追加し、目的の最終容量まで水を加えることによって行うことができます。このソリューションは、水浴や溶質を溶解するために、攪拌しながらホットプレート上で温めて必要となる場合があります。尿素は吸湿性であるため、尿素の原液の実際の濃度は、屈折率を用いて決定してください^1。
2. 20mMリン酸液（pH7.3）の株式の緩衝液が行われます。
3. 折り畳まタンパク質のストック溶液を調製した。この株式のタンパク質溶液は、8 M尿素、20 mMリン酸緩衝液で〜200μMの蛋白質の濃度を持つ必要があります。
4. 蛍光研究のためのサンプルは、次の方法で製造されています。株式の蛋白質の適切な量（2.3節）、株式の脂質溶液（5 mg / mLの脂質、第1項）、株式10 Mの尿素溶液（セクション2.1）、および株式のリン酸緩衝液（セクション2.2）〜4を含む試料を作るために結合されてμMタンパク質、1 mg / mLの脂質、および1 Mの単位で0〜8 M尿素。各サンプルの合計量は200μLです。例のスプレッドシート（​​表1）はリストのボリュームが200μMストックタンパク質溶液を使用して必要なことが含まれています。
5. ブランクサンプルは2.4節で説明するように作られている、しかし、タンパク質が追加されません。他の成分の濃度は、2.4節の場合と同じになるように、タンパク質の代わりに、8 M尿素溶液4μLを加えてもよい。これらのブランクが散乱し、タンパク質の蛍光スペクトルに現れる他のバックグラウンド信号を減算するために使用されます。
6. セクション2.4および2.5からのサンプルは完全な折り畳みと平衡を確保するための蛍光スペクトルの測定の前に少なくとも2時間、37℃でインキュベートされている。

3。蛍光スペクトルの測定

各サンプルとブランクのトリプトファンの蛍光は、定常状態蛍光光度計を用いて測定されます。蛍光スペクトルは、チロシン残基の励起を避けるために、290nmの励起波長で記録、および305〜500nmのスキャンする必要があります。典型的な入口と出口のバンドは3 nmである。波長の増加と積分時間は、信号対雑音比を最適化することができます。波長の増加と積分時間の典型的な値は1nm /ステップと、それぞれ0.5秒/ステップ、です。膜は、温度が二重層の相転移温度以上である場合にのみ合成脂質に一般的に倍のタンパク質。したがって、DMPCのこのケースでは、試料の温度は30℃一定に保たれています℃に160μLの容量を持つ微量石英キュベットは、これらの元で利用されているperiments。

4。アンフォールディング膜タンパク質のギブス自由エネルギーの初期アンフォールディング曲線と推定の世代

1. XYデータセットの形で蛍光スペクトルは、イゴールプロ、Matlabの、起源、またはExcelなどのソフトウェアにロードされます。
2. 尿素と脂質小胞のバックグラウンドからの信号は、次の手順を使用して減算する必要があります。
   脂質小胞と尿素の特定の濃度の存在下でタンパク質の=生の蛍光スペクトルスペクトル。
   ない蛋白質は、ブランク試料に存在しない、脂質小胞とスペクトルと同じ尿素の濃度を含む、対応するブランク試料のスペクトルは、B =生の蛍光スペクトル。
   補正スペクトル=スペクトラムA - C *スペクトルB. Cは1.0に典型的に等しいスカラです。いくつかのケースでは、Cが原因で発生する散乱問題のより小さいか1.0より大きいオーバーまたは〜305〜320 nm領域の近減算下。
3. 最大蛍光の波長_、λmaxは 、それぞれの尿素濃度の補正されたスペクトルから表にあらわしています。折り畳まれたタンパク質のそれは〜330 nmの間に完全に展開した膜タンパク質の典型的な値は350 nmである。表形式の波長は折り畳ま人口の割合には_λmaxの値を相関させるため0.0から1.0の範囲には_λmaxの値（〜350 nmまで〜330）の範囲を変換することで展開した分数に変換されます。例えば、330 nmの_λmaxの値が0.0に対応し、350nmのは、1.0に対応し、340nmのは、展開した分数の面で0.5に対応しています。折り畳まタンパク質のこの画分を尿素の濃​​度に対してプロットされている。前述したように、尿素の濃度は、屈折率を測定することによって実験的に決定されるべきである。
4. 我々は、タンパク質が2つの状態のいずれかに存在することができることを前提としています。折り曲げたり広げた。分数のプロットは、fを伸ばしたのに対し、尿素の濃度、Cは 、式に適合することができます^：2
   
   係数mは、変性剤濃度に対する自由エネルギーの変化率に相当し、そしてC _mは折られた人口が展開人口が等しくなる中間点の尿素の濃度に相当する。これらの値は、Rは （0.001987 kcal / molの•K）気体の法則は一定である。データ解析ソフトウェアによって最小二乗フィッティングから得られたフィッティングの変数であり、Tは （303 K）の温度である。
5. 近似​​から得られる係数は、尿素の存在下で展開のギブスの自由エネルギー量（kcal / mol）を決定するために利用されています： 。

5。アンフォールディングのギブス自由エネルギーのより正確な測定のためのアンフォールディング曲線を最適化。

1. 上記の展開曲線は_λmaxで最大の変化を引き起こす尿素濃度の範囲を明らかにする。この範囲は一般的に小さくなり、展開の大半は、この小さな範囲内で発生します。展開の自由エネルギーを正確に決定するために、追加のサンプルが最適化された最小二乗フィッティングのために必要な多くのデータポイントが含まれているプロットを取得するために、この領域で分析されます。より正確に展開曲線のこの重要な領域の形状を明らかにするために0.2 Mの単位で4 Mの尿素 - タンパク質が2と4 M尿素との間で繰り広げられるたとえば、サンプルは2を含むことを行うことができます。それは、それぞれの尿素濃度でブランクのスペクトルを測定する必要はなく、すべての〜0.5 Mのステップ空白のスペクトルを測定するのに十分です。
2. このプロットから得られた展開の自由エネルギーは、オリジナルの展開曲線で得られたものとは多少異なるが、より正確な値を反映している可能性があります。

6。代表的な結果：

表1。蛍光サンプルを作るのに必要な原液の量

図1単一のトリプトファン残基を含んでいる〜5μMの代表的な膜蛋白質のトリプトファン蛍光スペクトル。蛋白質の（A）生の蛍光スペクトル（スペクトル4.2から）、空白の（B）生の蛍光スペクトルは、（4.2からスペクトルB）、（C）4.2からスペクトルを修正しました。

図2は、。多数の尿素の濃度については、図1から膜タンパク質のトリプトファン蛍光スペクトルを修正しました。

図3。4.4に式に合わせて、図2のデータから得られた曲線を広げる。ギブスの自由エネルギーは、セクション4.5に従って計算されます。

現在のプロトコルは、トリプトファン残基を含む膜関連タンパク質およびペプチドの曲線を展開の生成を説明します。ここでは、トリプトファンの蛍光がタンパク質が折り畳まと合成脂質小胞に挿入、または溶液中で折り畳まれているかどうかを反映することを前提としています。追加のような変性剤濃度との自由エネルギーの二状態フォールディングと線形依存性などの仮定、、現在のレポートで作られて、別の方程式にこれらの仮定の結果の^変更を行う実験的なプロトコルは簡単に別の分光観測量を利用するように変更することができる、など。円二色性、吸収、または外因性色素からの蛍光は^、3と同様にゲル電気泳動など⁴さらに、アニオン性脂質などのグアニジン、酸性溶液、または温度だけでなく、別の脂質/小胞などの異なる変性剤、、、大単層小胞、またはミセルは、最終的に^5,6、プロトコルは、任意の膜タンパク質、膜関連ペプチド、及び可逆折りたたみの基準を満たしている水溶性タンパク質/ペプチドに適用することができます。活用、およびそれが示すことができる分光または他の異なる構造状態のための観測可能なマーカー。可溶性タンパク質の場合には、小胞は明らかにプロトコルから省略されています。

展開のギブス自由エネルギーは、生体分子を安定化させる非共有結合性相互作用への洞察を提供しています。私たちの研究室では、我々は、さまざまな場所で単一のトリプトファン残基を含む外膜タンパク質（のOmpA）の突然変異体の曲線を展開測定し、変異体は、5つのネイティブトリプトファン残基を含む野生型タンパク質に相対的な不安定化されていることを報告している^。7これらのアンフォールディングの研究は、水素結合と安定性の変化の根底にあるペアの相互作用、例えば、の分子の詳細を解明するために振動分光法を含む他の技術、、によって補完されています。要約すると、曲線を展開するのは比較的簡単な手法は、膜とタンパク質のフォールディングに関連付けられている熱力学を明らかにする可溶性タンパク質に適用することができます。