Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани

1. Приготовление растворов и материалов для вскрытия и поддержание культуры нейронных стволовых клеток

1. Подготовка 100мл рассечение среды (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) заранее и поставить в холодильник.
2. Prepare100 мл культуральной среды (Stem Pro НСК SFM, Invitrogen) и хранить при температуре 37 ° С на водяной бане.
3. Подготовка клеточного замораживания среды (KNOCKOUT DMEM/F12 +10% FBS + 5% ДМСО) на длительный срок криоконсервации клеток.
4. При необходимости, подготовить 4% параформальдегида (PFA) для фиксации ткани.
5. Стерильные, автоклавного щипцы и скальпель лезвиями с ручками используются для вскрытия.
6. Установите в сторону пистолет пипетки, пипетки 10 мл передачи, и 40 мкМ ячейки фильтра (BD Сокол 352340) для диссоциации.
7. Отложите несколько 10 см культуры блюд (BD) для вскрытия, 50 мл центрифужные пробирки (BD) для диссоциации, 1,5 мл пробирки центрифуги для хранения замороженных тканей и флаконах (BD) для замораживания клеток.

2. Изоляция человеческих нервных стволовых клеток из человеческого мозга плода

1. Заготовка жизнеспособные ткани сразу после окончания плода является жизненно важным для успеха процедуры. Для выборных процедур, сроки получить образцы могут быть организованы заранее, таким образом, чтобы минимизировать время после гибели плода. Продукты зачатия собирают в течение 2 часов после процедуры, но в идеале может быть достигнуто на выборные процедуры в течение нескольких минут. Фетальных тканей часто носят фрагментарный характер. Однако в целом значительная часть мозга остается неизменным для визуальной идентификации. Ограничения гестационного возраста (GA) определяются статутного права, но были выполнены с помощью этого протокола между 18-22 неделями GA.
2. Мозг плода помещают в 10 мл чашки Петри содержащие ледяной KNOCKOUT DMEM/F12 решение. Определить различные части коры анатомических ориентиров. Границы лобной и теменно-затылочной коре ориентированы экстраполированы пересечении центральной борозды и латеральной борозды. Рассеките тканей лобной коры кпереди от центральной борозды и вдоль границы с латеральной борозды хирургические лезвия, убедившись, что держать желудочка целости и сохранности.
3. Удалить остатки крови и мозговые оболочки из разделенных блок фронтальной коры головного мозга. Если образец достаточно высокого качества, она идеально подходит, чтобы рассекать блока на несколько небольших образцов для различных целей: разделы (фиксировали в 4% параформальдегида, PFA) и белок / РНК анализы (быстро замороженных в -80 ° С).
4. Передача выбранного блока мозга к 50 мл центрифужную пробирку и добавить ледяной KNOCKOUT DMEM/F12 решение примерно в 3 раза объема ткани в. Аккуратно отделить ткани от механических пипетки с пипеткой 10 мл передача, пока все ткани становится фрагментированным (как правило, в 20-30 раз), а затем фильтр клеток через 40 мкМ ячейки фильтра (BD Сокол 352 340), чтобы получить одну или вблизи одной клетки подвески.
5. Центрифуга клеточной суспензии при 2000 оборотах в минуту и ​​комнатной температуре в течение 5 мин, ресуспендируют осадок клеток в 10 мл теплой свежей питательной среды (Stem Pro НСК УЛП), и посчитайте количество клеток с гемоцитометра.
6. Добавьте 5 мл теплой питательной среды на каждые 25 см ² колбах культуры, и передача 2-10 ^{6 ячеек} в каждой колбе. Культур ведутся в 37 ° С / 5% СО ₂ инкубатора в течение 1 недели до анализа. Изменение половины среду один раз в неделю для дальнейшего культур или экспериментов.

3. Manipulaton нейронных стволовых клеток для дальнейшей характеристики или экспериментов

1. Нейросферы обычно формируются в 1 до 2 недель в рекомендованных условий культивирования диаметром НСК в диапазоне между 200 и 400 мкм. Нейросферы на данном этапе могут быть отделены с 0,2 г / л ЭДТА кальция и магния свободной Хэнкс среды (Хэнкс) при 37 ° С в течение 15 мин для получения одиночных клеток. Клетки подвески прядут при 2000 оборотах в минуту, промыть в пресной Хэнкс, и replated в теплую питательную среду для субкультуры.
2. Для начала дифференциации, диссоциированных клетки высевают на poly-D-lysine/laminin 1 покрытием покровные при плотности 1x10 ^{5 клеток} на покровное (24mmX24mm). Олигодендроцитов дифференциация достигается путем поддержания клеток в KNOCKOUT DMEM/F12 (Invitrogen, Главное, MD) +2% B27 (50х, Invitrogen, Главное, MD) +10 нг / мл bFGF +100 нг / мл SHH + 10ng/ml PDGF-АА 2 дня, то переход к той же среде без факторов роста в течение еще 5 дней. Нейронные дифференциация достигается путем поддержания клеток в KNOCKOUT DMEM/F12 +2% B27 (50х) в течение 7 дней. Астроцитов дифференциации осуществляется путем культивирования клеток в нокаут DMEM/F12 +1% FBS в течение недели.
3. Трансфекция нервных стволовых клеток с генами можно сделать с диссоциированных клеток из предварительно нейросферы. Здесь мы показали, нервные стволовые клетки трансфицированных EGFP-C1 путем электропорации. Электропорации EGFP-C1 построить было сделано с использованием AMAXA Nucleofector Наборы для мыши нервные стволовые клетки (ВПГ-1004) с AMAXA Nucleofector устройств (Lonza AAD-1001), следуя инструкции компании. Короче говоря, 5 мкг ДНК с 1 х 10 ^{6 клеток} смешивают с 100 мкл среды трансфекции, а после электропорации импульс, клетки ресуспендировали в нервные стволовые клетки поддержания среды для дальнейшего культуры. Дифференциация трансфекции клетки были обработаны с диссоциацией нейросферы 3-4 дня после электропорации, следуя той же процедуре, описанной в пункте 3.2.

4. Замораживание нервные стволовые клетки и субкультур

1. Расхождение между клеточные суспензии центрифугируют и ресуспендируют в морозную среду с концентрацией 1х10 ^{7 клеток} / флакон / мл. Медленно, замораживание клеток в -20 ° С, -80 ° C и трансфер в жидком азоте в течение длительного хранения.
2. Клетки быстро талой с 37 ° С водяной бане и ресуспендировали в подогретом DMEM/F12 +10% сыворотки для мытья, центрифугируют для удаления замерзания среды, и ресуспендировали в нагретой питательной среды.

5. Представитель Результаты:

Нервные стволовые клетки из нормального плода на 18 недель гестационного возраста культивируют следующие описаны методы и нейросферы можно увидеть через неделю с круглыми, гладкими границами и довольно однородный размер (рис. 2). Эти нейросферы можно трансфицированных EGFP-C1 или другие конструкции и применяемые в соответствии флуоресцентной микроскопии (рис.2б). Основанная нейросферы затем были диссоциированы с ЭДТА и высевают, как рассеянный клеток на покровных покрытием. Клетки дифференцированы в рамках соответствующих протоколов были зафиксированы с 4% parafamaldehyde, и окрашивали различные типа клеток специфических маркеров. Multipotentiality наблюдается с экспрессией маркеров свидетельствует о нейронов (Fig2C, D, родамин) астроциты (Fig2E, Ж, родамин) и олигодендроцитов (Fig2G, H, родамин). Клетки не претерпела электропорации EGFP также дифференцировались в различные типы клеток и окрашивают другой ячейке специфических маркеров. Multipotentiality наблюдается с экспрессией маркеров свидетельствует о нейронов (Fig3A, B, fluoroscein) астроциты (Fig3C, родамин и Fig3D, fluoroscein) и олигодендроцитов (Fig3E, Ж, родамин).

Рисунок 1. Схема экспериментальной процедуры, чтобы изолировать нервные стволовые клетки из выброшенных человеческого мозга плода

Рисунок 2. Недифференцированная и дифференцированная человеческих нервных клеток propogated в пробирке. (А) нейросферы показаны на этапе микроскопии отличие демонстрируют гладкие, круглые границы и быстрый рост после культуре более 1 недели. (Б) введение различных плазмид и конструкций может быть достигнуто путем трансфекции. Три дня после EGFP-C1 трансфекции, несколько ячеек показать выражение зеленого флуоресцентного белка, как видно по fluoroscein иммунной и флуоресцентной микроскопии. EGFP-C1 трансфицированных нейросферы разобщены и дифференцированных в различных условиях в нейроны (C, D), астроциты (E, F) и олигодендроцитов (G, H) и видел под родамина флуоресценции. Одновременно с этим, трансфицированных EGFP положительных клеток показаны под fluoroscein флуоресценции. Трансфицированных клеток (белые головки стрелка) ничем не отличаются от untransfected клеток (белые стрелки). Ядра клеток окрашиваются с Hoechst33342. Шкала бары 200 мкм, 100 мкм для B и 25 мкм для CH.

Рисунок 3. Нейросферы без трансфекции разобщены и дифференцированных в различных условиях в нейроны (A, B, fluoroscein), астроциты (С, родамин, D, fluoroscein) и олигодендроцитов (E, F, родамин). Ядра клеток окрашиваются с Hoechst33342. Шкала баров 25 мкм для автофокусировки.

Существуют различные подходы к культуре свежей ткани и производство человеческих клеточных линий. Исторически сложилось так, свежей ткани были собраны и культурным сразу генерировать различные типы клеток в центральной нервной системе. Этот подход, однако, четко ограничено количество образцов, которые могут быть получены, который в случае человеческих образцов, как правило, довольно мала. Учитывая минимальную степень манипуляции, только культурный нервные клетки обеспечивают наиболее надежные экспериментальные системы, ограничивая потенциал артефакты из расширенных культивирования. Ограниченного предложения привел к второму подходу получения человеческих клеточных линий, которые были увековечены через вставку различных онкогенов ^{12, 13.} Забота о такой подход лежал в возможность того, что онкогенные манипуляции этих клеток изменит свойства ячеек. Кроме того, часть обоснование для создания человеческих клеточных линий был потенциал для трансплантации и лечения различных болезней человека. Иммортализованные клеточных линий может предрасполагают к риску рост злокачественной опухоли. Преимущество этих клеточных линий равномерность линий, их способность к принятию различных нервных и глиальных фенотипы присущие область мозга, и легкость получения большого количества культур. Чтобы преодолеть потенциальные онкогенные ограничения, различные подходы были использованы для культивирования первичных человеческих нервных стволовых клеток. Большинство методы основаны на ЭФР и bFGF манипуляции клеток, адгезии или технологии подвески культуры. Эти различные подходы приводят к различной чистоты ННЦ ^14. Свендсен и соавт. сообщила метод культуры НСК по разделам формируется нейросферы с межклеточных контактов поддерживаться (15), которая может дать богатую производство НБК в течение короткого времени. Тем не менее, олигодендроцитов не могут быть получены с этими нейросферы на поздних пассажах. Обогащение нейросферы с ЭФР и bFGF может также изменить транскрипционной и клеточных фенотипов в пробирке ^14. Использование древних культур проход обеспечивает разумный компромисс между потребностью в больших количествах культур и как минимум озабоченность по внедрению культуры артефакт. В последнее время успехи были достигнуты в поколение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток принудительным выражением подмножество генов, необходимых для поддержания свойств стволовых клеток. IPS клетки имеют преимущество в предоставлении большого количества человеческих клеток, а также потенциалом для создания самых разных типов клеток, составляющих организм человека. В настоящее время это последнее преимущество и делает эту модель системы менее привлекательными в этом сигнальных механизмов, чтобы трансформировать клетки к определенному типу клеток (то есть переднего мозга нейроны) не известны.

Текущие методы, описанные для генерации человеческого NSCs предоставить некоторые незначительные вариации из других опубликованных подходов. Большинство предыдущих методов использования различных ферментативных или химических средств клеточной диссоциации (трипсина и папаин), чтобы отделить НСК из фетальных коры головного мозга. В общем, учитывая большое количество ткани, мы используем нежной механической растирания с тонкой фильтрации ячейки для получения жизнеспособных одной клетки, которые прошли минимальные манипуляции. Более того, такой подход сводит к минимуму время от ткани урожая культивирования тканей / хранения, что особенно важно для человека образцов.

Этот протокол описывает, как изолировать человека нервные стволовые клетки из выброшенных фронтальной корковой ткани ^7,9,10,11. Методология выделения нейросферы немного варьируется между человеком и мышей, с подходом, описанным здесь, оптимизированных для получения одноклеточных суспензий в образцов человеческой ткани. Есть несколько соображений в использовании человеческих тканей. В первую очередь это ограничения времени после гибели плода до начала диссоциации клеток и уборки урожая. Эта проблема может быть смягчена до планирования выборных абортов и сохранение образцов при температуре 4 ° C. Во-вторых, важно, чтобы попытаться определить ориентиры для диссоциации корковой ткани. С этой целью полезно проинформировать врача выполняет неудачную процедуру, чтобы попытаться сохранить целостность мозга, когда это возможно. В-третьих, важно понимать, что масштаб человеческих мозга плода даже в 18-22 недель намного превосходит даже взрослой мыши или крысы, и поэтому необходимо выполнить диссоциации, фильтрации и промывки большей пропускной способности системы (то есть больше пластиковая посуда, 10 мл пластиковый пипец против стекла полированного пипец, несколько образцов обрабатываются параллельно). В-четвертых, клетки механически диссоциированы и не надо убедиться, что все фрагменты ткани ушли. Скорее, это предпочтительнее, чтобы минимизировать растиранием как можно больше, при том понимании, что фильтрация будет удалить ненужные больше фрагментов тканей и отдельных достаточно индивидуальный NSCs от широкой выборки для культивирования. В-четвертых, реактивы выбрали оптимизированы для человека нейросферы. Наконец, опе должны постараться не нарушать отдельные клетки после их покрытие, так, чтобы минимизировать агрегации.

Как только человеческие нервные стволовые клетки сформировали клональной сферах, они могут быть отделены в одиночных камерах, как описано выше, и пассировать выяснить самообновлению возможности или дифференцировались в различные типы клеток, используя различные комбинации факторов роста и / или белков.