Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel

1. De voorbereiding van oplossingen en materialen voor dissectie en het onderhoud van neurale stamcellen cultuur

1. Bereid 100ml dissectie medium (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) van tevoren in de koelkast.
2. Prepare100 ml kweekmedium (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) en houdt bij 37 ° C in een waterbad.
3. Bereid cel-bevriezing medium (KNOCKOUT DMEM/F12 +10% FBS + 5% DMSO) voor lange termijn cryopreservatie van cellen.
4. Indien gewenst, voor te bereiden 4% paraformaldehyde (PFA) voor weefsel fixatie.
5. Steriel, geautoclaveerd pincet en scalpel bladen met handgrepen worden gebruikt voor dissectie.
6. Vernietiging van een pipet pistool, 10 ml overdracht pipetten, en 40 uM cel zeef (BD Falcon 352.340) voor dissociatie.
7. Gereserveerd diverse 10 cm kweekschalen (BD) voor dissectie, 50 ml centrifugebuis (BD) voor dissociatie, 1,5 ml centrifuge buizen voor weefsel opslag en bevroren flesjes (BD) voor het invriezen van cellen.

2. Isoleren van menselijke neurale stamcellen uit de menselijke foetale hersenen

1. Het oogsten van levensvatbaar weefsel direct na beëindiging van de foetus is van vitaal belang voor het succes van de procedure. Voor electieve procedures, kan de timing van monsters te verkrijgen zijn op voorhand zodat u de tijd na het foetaal overlijden te minimaliseren. De producten van de conceptie worden geoogst binnen 2 uur na de procedure, maar idealiter kan worden bereikt op electieve procedures binnen enkele minuten. De foetale weefsels vaak gefragmenteerd. Echter, in het algemeen een aanzienlijk deel van de hersenen intact blijft voor visuele identificatie. Beperkingen van de zwangerschapsduur (GA) wordt bepaald door de wettelijke wet, maar zijn uitgevoerd met behulp van dit protocol tussen de 18-22 weken GA.
2. Foetale hersenen wordt geplaatst in een 10 ml petrischaal met ijskoude KNOCKOUT DMEM/F12 oplossing. Identificeer de verschillende delen van de cortex door anatomische oriëntatiepunten. Grenzen voor de frontale en parietooccipitalis cortex zijn gericht door de geëxtrapoleerde kruising van de centrale sulcus en Sylvian spleet. Ontleden weefsel van de frontale cortex anterior naar de centrale sulcus en langs de rand van de Sylvian spleet met chirurgische mesjes, zorg ervoor dat houden het ventrikel intact en onbeschadigd.
3. Verwijder eventuele resterende bloed en de hersenvliezen van de gescheiden blok van frontale cortex. Als het monster van voldoende kwaliteit is, is het ideaal om het blok te ontleden in meerdere kleinere monsters voor verschillende doeleinden: secties (gefixeerd in 4% paraformaldehyde, PFA) en eiwit / mRNA assays (snel ingevroren in -80 ° C).
4. Overdracht van de geselecteerde hersenen blok naar een centrifugebuis van 50 ml en voeg ijskoude KNOCKOUT DMEM/F12 oplossing op ongeveer 3 keer het volume van het weefsel. Voorzichtig losmaken van het weefsel door mechanische pipetteren met een 10 ml transferpipet tot alle weefsels gefragmenteerd raakt (meestal 20-30 keer), en vervolgens de cellen filter door middel van een 40 uM cel zeef (BD Falcon 352340) om een ​​enkele of in de buurt enkele cel te krijgen opschorting.
5. Centrifugeer de celsuspensie bij 2000 rpm en kamertemperatuur gedurende 5 minuten, resuspendeer de cel pellet in 10 ml vers warm kweekmedium (Stem Pro NSC SFM), en tel het aantal cellen met een hemocytometer.
6. Voeg 5 ml warm kweekmedium in elkaar 25 cm ² flessen cultuur, en de overdracht 2x10 ⁶ cellen aan elke kolf. Culturen worden onderhouden in een 37 ° C / 5% CO ₂ incubator voor 1 week voor de analyse. Wijzig de helft van de medium een ​​keer per week voor verdere culturen of experimenten.

3. Manipulaton van neurale stamcellen voor verdere karakterisering of experimenten

1. Neurospheres vormen meestal in 1 tot 2 weken onder de aanbevolen cultuur voorwaarden met NSC diameter tussen 200 en 400 micrometer. Neurospheres in dit stadium kan losgekoppeld worden met 0,2 g / L EDTA aan calcium en magnesium vrij Hanks medium (Hanks) bij 37 ° C gedurende 15 minuten om enkele cellen te verkrijgen. Celsuspensie worden gesponnen bij 2000 tpm, gespoeld in verse Hanks, en opnieuw uitgeplaat in warme voedingsbodem voor subcultuur.
2. Het initiëren differentiatie, kunnen worden gescheiden door cellen uitgeplaat op poly-D-lysine/laminin een beklede dekglaasjes bij een dichtheid van 1x10 ⁵ cellen per dekglaasje (24mmX24mm). Oligodendrocyt differentiatie wordt bereikt door het handhaven van de cellen in KNOCKOUT DMEM/F12 (Invitrogen, Main, MD) +2% B27 (50X, Invitrogen, Main, MD) +10 ng / ml bFGF +100 ng / ml SHH + 10ng/ml PDGF-AA voor 2 dagen, dan schakelen naar hetzelfde medium zonder groeifactoren voor nog 5 dagen. Neuronale differentiatie wordt bereikt door het handhaven van cellen in KNOCKOUT DMEM/F12 +2% B27 (50X) gedurende 7 dagen. Astrocyten differentiatie wordt gedaan door het kweken van cellen in KNOCKOUT DMEM/F12 +1% FBS voor een week.
3. Transfectie van neurale stamcellen met genen kan worden gedaan met gescheiden cellen van de voorgevormde neurospheres. Hier toonden we de neurale stamcellen getransfecteerd met EGFP-C1 door elektroporatie. De elektroporatie van EGFP-C1 construct werd gedaan met behulp van AMAXA Nucleofector Kits voor Mouse neurale stamcellen (VPG-1004) met AMAXA Nucleofector Device (Lonza AAD-1001), na instructie van het bedrijf. In het kort werden 5 ug DNA met 1 x 10 ⁶ cellen gemengd met 100 ul transfectie medium, en na de puls elektroporatie, de cellen werden geresuspendeerd in de neurale stamcellen onderhouden medium voor verdere cultuur. De differentiatie van getransfecteerde cellen werden verwerkt met de dissociatie van neurospheres 3-4 dagen na de elektroporatie, volgens dezelfde procedures beschreven in stap 3.2.

4. Invriezen neurale stamcellen en subculturen

1. Gedissocieerd celsuspensies worden gecentrifugeerd en geresuspendeerd in de vrieskou medium met een concentratie van 1x10 ⁷ cellen / flacon / ml. Langzaam bevriezen de cellen in -20 ° C, -80 ° C dan naar vloeibare stikstof transfer voor langdurige opslag.
2. De cellen zijn snel ontdooid met 37 ° C waterbad en geresuspendeerd in verwarmde DMEM/F12 +10% serum voor een wasbeurt, gecentrifugeerd om de bevriezing medium te verwijderen, en opnieuw gesuspendeerd in de verwarmde kweekmedium.

5. Representatieve resultaten:

Neurale stamcellen van een normale foetus bij 18 weken zwangerschapsduur werden gekweekt volgens de beschreven methoden en neurospheres kan worden gezien na een week met ronde, gladde randen en vrij homogene grootte (fig. 2a). Deze neurospheres kunnen worden getransfecteerd met EGFP-C1 of andere constructies en volgde onder fluorescentie microscopie (Fig.2B,). Gevestigde neurospheres werden vervolgens gedissocieerd met EDTA en vergulde als geïsoleerde cellen op gecoate dekglaasjes. Cellen onderscheiden onder de respectieve protocollen werden gefixeerd met 4% parafamaldehyde, en gekleurd met verschillende celtype specifieke markers. Multipotentiality wordt waargenomen met de expressie van markers indicatie van de neuronen (Fig2C, D, rhodamine) astrocyten (Fig2E, F, rhodamine) en oligodendrocyten (Fig2G, H, rhodamine). De cellen ondergaan elektroporatie van EGFP werden ook onderscheiden in verschillende celtypes en gekleurd met verschillende cel-specifieke markers. Multipotentiality wordt waargenomen met de expressie van markers indicatie van de neuronen (Fig3A, B, fluoroscein) astrocyten (Fig3C, rhodamine en Fig3D, fluoroscein) en oligodendrocyten (Fig3E, F, rhodamine).

Figuur 1. Schema van de experimentele procedure om neurale stamcellen te isoleren uit afgedankte menselijke foetale hersenen

Figuur 2. Ongedifferentieerde en gedifferentieerde menselijke neurale cellen propogated in vitro. (A) Neurospheres zijn opgenomen onder fase-contrast-microscopie aan te tonen gladde, ronde randen en de snelle groei na de cultuur voor meer dan 1 week. (B) Introductie van de verschillende plasmiden en constructen kunnen worden bereikt door transfectie. Drie dagen na de EGFP-C1 transfectie, meerdere cellen vertonen expressie van het groen fluorescent eiwit als gezien onder fluoroscein immunokleuring en fluorescentie microscopie. EGFP-C1 getransfecteerde neurospheres worden gescheiden en gedifferentieerde onder verschillende omstandigheden in de neuronen (C, D), astrocyten (E, F) en oligodendrocyten (G, H) en gezien onder rhodamine fluorescentie. Tegelijkertijd worden getransfecteerd EGFP positieve cellen weergegeven onder fluoroscein fluorescentie. Getransfecteerde cellen (witte pijlpunten) zijn niet te onderscheiden van ongetransfecteerde cellen (witte pijlen). De celkernen zijn gekleurd met Hoechst33342. Schaal bars zijn 200 pm voor A, 100 micrometer voor B en 25 urn voor CH.

Figuur 3. Neurospheres zonder transfectie worden gescheiden en gedifferentieerde onder verschillende omstandigheden in de neuronen (A, B, fluoroscein), astrocyten (C, rhodamine, D, fluoroscein) en oligodendrocyten (E, F, rhodamine). De celkernen zijn gekleurd met Hoechst33342. Schaal bars zijn 25 urn voor AF.

Er zijn verschillende benaderingen in de richting van cultuur verse weefsel en de productie van menselijke cellijnen. Historisch gezien is fris weefsel geoogst en onmiddellijk gekweekt om verschillende celtypes in het centrale zenuwstelsel te genereren. Deze benadering wordt echter duidelijk beperkt door het aantal monsters dat kan worden verkregen, die in het geval voor de menselijke monsters, is het meestal vrij klein. Gezien de minimale mate van manipulatie, vers gekweekte neurale cellen zorgen voor de meest betrouwbare experimentele systeem door het beperken van mogelijke artefacten uit uitgebreid kweken. Het beperkte aanbod leidde tot een tweede benadering van het genereren van menselijke cellijnen die waren vereeuwigd door het inbrengen van verschillende oncogenen ^{12, 13.} De zorg voor deze aanpak lag in de mogelijkheid dat oncogene manipulatie van deze cellen zou de cel eigenschappen veranderen. Bovendien, een deel van de beweegredenen voor het genereren van humane cellijnen werd het potentieel voor transplantatie en de behandeling van verschillende menselijke aandoeningen. Onsterfelijk gemaakte cellijnen een verhoogde kans hebben om het risico van kanker groei. Het voordeel van deze cellijnen is de uniformiteit van de lijnen, hun vermogen om de verschillende neuronale en gliale fenotypen die inherent zijn aan een regio van de hersenen vast te stellen, en het gemak van het genereren van grote aantal culturen. Te overwinnen het potentieel oncogene beperkingen, zijn verschillende benaderingen zijn gebruikt voor het kweken van primaire menselijke neurale stamcellen. De meeste methoden zijn gebaseerd op EGF en bFGF manipulatie van cellen, met een hechting of opschorting cultuur technieken. Deze verschillende benaderingen leiden tot verschillende zuiverheden van NSC ^14. Svendsen et al.. rapporteerde een methode van NSC cultuur door deel van de gevormde neurospheres met het onderhouden cel-cel contacten (15), die een rijke productie van NSC in een korte tijd kan geven. Kan echter oligodendrocyt niet worden verkregen met deze neurospheres op latere passages. Verrijken neurospheres met EGF en bFGF kan ook de transcriptie en cellulaire fenotypes in vitro ^14. Het gebruik van de vroege passage culturen zorgt voor een redelijk compromis tussen de noodzaak voor grote aantallen van culturen en de minste zorg voor de invoering van de cultuur artefact. Recentelijk hebben vooruitgang geboekt in de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door gedwongen expressie van een subset van genen die nodig is om stamcellen te behouden. IPS-cellen hebben het voordeel van het verstrekken van grote hoeveelheden van menselijke cellen, alsook de mogelijkheid om alle verschillende soorten cellen die het menselijk lichaam bestaat uit genereren. Momenteel is deze laatste voordeel maakt het ook dit model systeem minder aantrekkelijk, omdat de signalering mechanismen om cellen te transformeren tot een bepaald celtype (dat wil zeggen voorhersenen neuronen) zijn niet bekend.

De huidige methoden beschreven voor het genereren van de menselijke NSCs bieden enige lichte variaties van andere gepubliceerde benaderingen. De meeste eerdere methoden gebruik maken van diverse enzymatische of chemische middelen van cel dissociatie (trypsine of papaïne) om de NSC distantiëren van foetale cortex. In het algemeen, gezien de grote hoeveelheid weefsel, gebruiken we zachte mechanische tritureren met fijne cel filtratie om levensvatbare enkele cellen die hebben ondergaan een minimale manipulatie te verkrijgen. Bovendien is deze aanpak minimaliseert de tijd van oogst tot weefsel weefsel kweken / opslag, dat is van cruciaal belang voor de menselijke monsters.

Dit protocol beschrijft hoe de menselijke neurale stamcellen te isoleren uit afgedankte frontale corticale weefsel ^7,9,10,11. De methodologie voor het isoleren van de neurospheres verschilt enigszins tussen mens en muizen, met de aanpak die hier beschreven geoptimaliseerd voor het verkrijgen van single-cell suspensies in menselijk weefsel monsters. Er zijn verschillende overwegingen bij het gebruik van menselijk weefsel. Eerst en vooral is het beperken van de tijd na foetale overlijden voorafgaand aan de aanvang van de cel dissociatie en oogsten. Dit probleem kan worden beperkt door vooraf planning van electieve abortus en onderhouden van monsters bij 4 ° C. Ten tweede is het belangrijk om te proberen oriëntatiepunten voor de dissociatie van de corticale weefsel te identificeren. In de richting van dit doel, is het nuttig om op de hoogte van de arts het uitvoeren van de mislukte procedure om te proberen de hersenen integriteit te behouden waar mogelijk. Ten derde is het belangrijk om te beseffen dat de omvang van het menselijke foetale hersenen, zelfs bij 18 tot 22 weken ver uitstijgt boven dat van zelfs een volwassen muis of rat en dus de noodzaak om de dissociatie, filtratie en wassen met een grotere doorvoer systeem uit te voeren (dat wil zeggen grotere kunststofmateriaal, 10 ml plastic pipetten vs glas gepolijst pipetten, meerdere monsters verwerkt in parallel). Vierde, de cellen zijn mechanisch los en het is niet nodig om te zorgen dat alles in het weefsel fragmenten zijn verdwenen. Het is eerder de voorkeur om tritureren minimaliseren zo veel mogelijk, met dien verstande dat filtratie zal de ongewenste grotere weefselfragmenten en aparte genoeg individuele NSCs te verwijderen uit de grotere steekproef voor het kweken. Vierde, zijn gekozen de reagentia geoptimaliseerd voor de menselijke neurospheres. Tot slot, one moeten proberen niet om individuele cellen te verstoren nadat ze zijn bedekt, zodat aggregatie te minimaliseren.

Zodra de menselijke neurale stamcellen hebben gevormd klonale bollen, kunnen ze worden gescheiden in afzonderlijke cellen zoals hierboven beschreven, en de gepasseerde om na te gaan zelfvernieuwing mogelijkheden of gedifferentieerd in de verschillende celtypen met verschillende combinaties van groeifactoren en / of eiwitten.