Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

1. Preparazione di soluzioni e materiali per la dissezione e la conservazione della cultura di cellule staminali neurali

1. Preparare 100 ml di media dissezione (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) in anticipo e conservare in frigorifero.
2. Prepare100 ml di terreno di coltura (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) e tenere a 37 ° C a bagnomaria.
3. Preparare il congelamento delle cellule-media (KNOCKOUT DMEM/F12 +10% FBS + 5% DMSO) a lungo termine crioconservazione delle cellule.
4. Se lo si desidera, preparare il 4% paraformaldeide (PFA) per il fissaggio del tessuto.
5. Sterili, pinze e lame bisturi in autoclave con maniglie vengono utilizzati per la dissezione.
6. Mettere da parte una pistola pipetta, 10 ml di pipette di trasferimento, e 40 filtro cellule mM (BD Falcon 352.340) per la dissociazione.
7. Mettere da parte 10 piatti diversi cultura cm (BD) per la dissezione, 50 provette ml (BD) per la dissociazione, 1,5 ml, provette per la conservazione dei tessuti e fiale congelate (BD) per celle di congelamento.

2. Isolare cellule staminali neurali dal cervello fetale umano

1. La raccolta di tessuti vitali immediatamente dopo la cessazione del feto è vitale per il successo della procedura. Per le procedure elettive, i tempi per ottenere i campioni possono essere organizzati in anticipo in modo da ridurre al minimo il tempo dopo la morte del feto. I prodotti del concepimento sono raccolti nella procedura a 2 colonne ore, ma idealmente può essere realizzato su procedure elettive in pochi minuti. I tessuti fetali sono spesso frammentati. Tuttavia, in generale, una significativa porzione del cervello rimane intatto per l'identificazione visiva. Limiti di età gestazionale (GA) sono determinate dalla legge scritta, ma sono state effettuate utilizzando questo protocollo tra 18-22 settimane GA.
2. Cervello fetale è posto in un piatto da 10 ml Petri contenenti ghiacciata KNOCKOUT DMEM/F12 soluzione. Identificare le diverse parti della corteccia da punti di repere anatomici. Confini per la corteccia frontale e parieto-occipitale sono orientate dall'intersezione estrapolati del solco centrale e fessura Sylvian. Sezionare il tessuto dalla corteccia frontale anteriore al solco centrale e lungo il bordo della fessura silviana con lame chirurgiche, evitando di mettere il ventricolo integro e non danneggiato.
3. Rimuovere eventuali residui di sangue e meningi dal blocco separato della corteccia frontale. Se il campione è di qualità sufficiente, è ideale per sezionare il blocco in diversi campioni più piccole per vari scopi: sezioni (fissate in 4% paraformaldeide, PFA) e di proteine ​​/ mRNA test (veloce congelati in -80 ° C).
4. Trasferire il blocco selezionato cervello in una provetta da centrifuga da 50 ml e aggiungere ghiacciata KNOCKOUT DMEM/F12 soluzione a circa 3 volte il volume del tessuto. Delicatamente dissociare il tessuto pipettando meccanico con una pipetta 10 ml di trasferimento fino a che tutti i tessuti diventa frammentata (generalmente 20-30 volte), e quindi filtrare le cellule attraverso una cella di 40 micron filtro (BD Falcon 352340) per ottenere uno o vicino a singola cella sospensione.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 2000 giri e la temperatura ambiente per 5 minuti, risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno fresco cultura caldo (Stem Pro NSC SFM), e contare il numero di cellule con un emocitometro.
6. Aggiungere 5 ml di mezzo di coltura caldo in ogni cm 25 ² fiasche cultura, e il trasferimento 2X10 ⁶ celle ad ogni pallone. Le culture sono mantenuti a 37 ° C / 5% CO ₂ incubatore per 1 settimana prima dell'analisi. Cambia la metà della media una volta alla settimana per le culture più o esperimenti.

3. Manipulaton di cellule staminali neurali per la caratterizzazione ulteriore o sperimentazioni

1. Neurosfere di solito forma in 1 o 2 settimane in condizioni di coltura NSC raccomandata con diametro compreso tra 200 e 400 micron. Neurosfere in questa fase può essere dissociata con 0,2 g / L di EDTA di calcio e magnesio libero Hanks medio (Hanks) a 37 ° C per 15 minuti per ottenere cellule singole. Sospensione le cellule sono filata a 2000 giri al minuto, sciacquate in acqua dolce Hanks, e saltuariamente nel terreno di coltura caldo per sottocultura.
2. Per avviare la differenziazione, le cellule dissociate sono placcati in poly-D-lysine/laminin 1 vetrini rivestiti con una densità di 1x10 ⁵ cellule per vetrino (24mmX24mm). Differenziazione degli oligodendrociti si ottiene mantenendo le cellule in KNOCKOUT DMEM/F12 (Invitrogen, Main, MD) +2% B27 (50X, Invitrogen, Main, MD) +10 ng / ml bFGF 100 ng / ml SHH + 10ng/ml di PDGF-AA 2 giorni, poi il passaggio al mezzo stesso, senza fattori di crescita per altri 5 giorni. Differenziamento neuronale è ottenuto da cellule mantenendo in KNOCKOUT DMEM/F12 +2% B27 (50X) per 7 giorni. Differenziazione astrociti è fatto da cellule in coltura KNOCKOUT DMEM/F12 +1% FBS per una settimana.
3. Trasfezione delle cellule staminali neurali con i geni può essere fatto con cellule dissociate dalla neurosfere preformate. Qui, abbiamo dimostrato che le cellule staminali neuronali transfettate con EGFP-C1 mediante elettroporazione. L'elettroporazione di EGFP-C1 costruire è stato fatto usando AMAXA Kit Nucleofector per cellule staminali neurali del mouse (VPG-1004) con dispositivo AMAXA Nucleofector (Lonza DAA-1001), a seguito di istruzione della società. In breve, 5 mg di DNA con 1 x 10 ⁶ cellule sono state mescolate con 100 microlitri di media transfezione, e dopo l'elettroporazione di impulsi, le cellule sono state risospese in cellule staminali neurali mantenendo media per la cultura ulteriormente. La differenziazione delle cellule transfettate sono stati trattati con la dissociazione di giorni neurosfere dopo 3-4 l'elettroporazione, seguendo le stesse procedure descritte al punto 3.2.

4. Congelamento delle cellule staminali neurali e sottoculture

1. Sospensioni cellulari dissociate sono centrifugate e risospese in medium di congelamento con una concentrazione di 1x10 ⁷ cellule / flacone / ml. Lentamente congelare le cellule in -20 ° C, -80 ° C, poi il trasferimento a azoto liquido per la conservazione a lungo.
2. Le cellule sono veloci scongelati con 37 ° C bagnomaria e risospese in riscaldato DMEM/F12 +10% siero per un lavaggio, centrifugato per rimuovere il supporto di congelamento, e risospeso nel terreno di coltura riscaldato.

5. Rappresentante dei risultati:

Cellule staminali neurali da un feto normale a 18 settimane di età gestazionale sono stati coltivati ​​secondo i metodi descritti e neurosfere si può vedere dopo una settimana con il turno, bordi lisci e le dimensioni abbastanza omogeneo (Fig.2a). Questi neurosfere possono essere transfettate con EGFP-C1 o altri costrutti e seguita al microscopio a fluorescenza (Fig.2b,). Fondata neurosfere sono state poi dissociato con EDTA e placcato come cellule disperse su vetrini rivestiti. Cellule differenziate secondo i protocolli sono stati fissati rispettivamente con il 4% parafamaldehyde, e colorati con marcatori diversi tipi cellulari specifici. Multipotenzialità si osserva con l'espressione di marcatori indicativi di neuroni (Fig2C, D, rodamina) astrociti (Fig2E, F, rodamina) e gli oligodendrociti (Fig2G, H, rodamina). Le cellule non subito elettroporazione di EGFP sono state differenziate in diversi tipi di cellule e colorati con differenti marcatori cellulari specifici. Multipotenzialità si osserva con l'espressione di marcatori indicativi di neuroni (Fig3A, B, fluoroscein) astrociti (Fig3C, rodamina e Fig3D, fluoroscein) e gli oligodendrociti (Fig3E, F, rodamina).

Figura 1. Schematica della procedura sperimentale per isolare le cellule staminali neurali da scartati cervello fetale umano

Figura 2. Cellule umane indifferenziate e differenziate propogated neurali in vitro. (A) neurosfere sono mostrati al microscopio a contrasto di fase dimostrare lisce, i bordi rotondi e una rapida crescita dopo la cultura per oltre 1 settimana. (B) Introduzione di plasmidi diversi e costruisce può essere raggiunto attraverso trasfezione. Tre giorni dopo EGFP-C1 transfezione, le cellule mostrano più espressione della proteina fluorescente verde come si è visto sotto immunocolorazione fluoroscein e microscopia a fluorescenza. EGFP-C1 neurosfere transfettate sono dissociate e differenziati in diverse condizioni in neuroni (C, D), gli astrociti (E, F) e gli oligodendrociti (G, H) e visto sotto fluorescenza rodamina. Allo stesso tempo, transfettate cellule EGFP positivi sono indicati sotto fluoroscein fluorescenza. Cellule transfettate (teste di freccia bianca) sono indistinguibili dalle cellule untransfected (frecce bianche). I nuclei delle cellule sono colorate con Hoechst33342. Barre di scala sono 200 micron per A, B per 100 micron e 25 micron per CH.

Figura 3. Neurosfere senza trasfezione sono dissociata e differenziata in diverse condizioni in neuroni (A, B, fluoroscein), gli astrociti (C, rodamina, D, fluoroscein) e gli oligodendrociti (E, F, rodamina). I nuclei delle cellule sono colorate con Hoechst33342. Barre di scala sono 25 micron per AF.

Ci sono vari approcci verso la cultura del tessuto fresco e la produzione di linee cellulari umane. Storicamente, tessuto fresco è stato raccolto e colto immediatamente di generare vari tipi di cellule del sistema nervoso centrale. Questo approccio però è chiaramente limitata dal numero di campioni che possono essere ottenuti, che nel caso di campioni umani, di solito è abbastanza piccolo. Dato il grado minimo di manipolazione, le cellule neuronali in coltura fresco fornire il sistema più affidabile sperimentale, limitando gli artefatti potenziale da coltura estesa. L'offerta limitata portato a un secondo approccio di generare linee cellulari umane che era stato immortalato attraverso l'inserimento di diversi oncogeni ^{12, 13.} La preoccupazione per questo approccio laico nella possibilità che la manipolazione oncogenica di queste cellule possano modificare le proprietà delle celle. Inoltre, uno dei motivi per generare linee cellulari umane è stata la possibilità per il trapianto e nel trattamento di diverse patologie umane. Linee cellulari immortalizzate può predisporre al rischio di crescita del cancro. Il vantaggio di queste linee cellulari è l'uniformità delle linee, la loro capacità di adottare i diversi fenotipi neuronali e gliali insiti in una regione del cervello, e la facilità di generare gran numero di culture. Per superare le limitazioni potenziale oncogeno, diversi approcci sono stati usati per la coltura principale cellule staminali neurali. La maggior parte dei metodi sono basati su EGF e bFGF manipolazione di cellule, con l'adesione o tecniche di coltura sospensione. Questi diversi approcci risultato in purezza differenti di NSC ^14. Svendsen et al. riportato un metodo di cultura NSC per sezione di neurosfere formato con la cellula-cellula mantenuto i contatti (15), che possono dare una ricca produzione di NSC in breve tempo. Tuttavia, oligodendrociti non può essere ottenuto con queste neurosfere in passaggi più tardi. Neurosfere arricchendo con EGF e bFGF può anche alterare i fenotipi trascrizionale e cellulari in vitro ^14. Uso di colture passaggio iniziale fornisce un ragionevole compromesso tra la necessità di un gran numero di culture e la minima preoccupazione per l'introduzione di un artefatto culturale. Più recentemente, i progressi sono stati fatti nella generazione di cellule staminali pluripotenti indotte dalla espressione forzata di un sottoinsieme di geni necessari per mantenere le proprietà delle cellule staminali. Le cellule IPS hanno il vantaggio di fornire grandi quantità di cellule umane e la potenzialità di generare tutti i diversi tipi di cellule che compongono il corpo umano. Attualmente, questo ultimo vantaggio rende questo modello di sistema meno attraente in quanto i meccanismi di segnalazione per trasformare le cellule ad un particolare tipo di cellula (per esempio i neuroni del proencefalo) non sono noti.

Gli attuali metodi descritti per la generazione di NSCs umano fornire alcune piccole variazioni da altri approcci pubblicati. La maggior parte dei metodi precedenti utilizzano vari enzimatici o chimici delle cellule dissociazione (tripsina o papaina) per dissociare il NSC dalla corteccia fetale. In generale, data la grande quantità di tessuto, usiamo dolce triturazione meccanica con celle di filtrazione fine per ottenere praticabile singole cellule che hanno subito la manipolazione minima. Inoltre, questo approccio minimizza il tempo dalla raccolta dei tessuti a coltura dei tessuti / storage, che è critica per i campioni umani.

Questo protocollo descrive come isolare cellule staminali neurali da scartati tessuto corticale frontale ^7,9,10,11. La metodologia per isolare le neurosfere varia leggermente tra umani e topi, con l'approccio descritto qui ottimizzato per ottenere monocellulari sospensioni in campioni di tessuto umano. Ci sono varie considerazioni l'uso di tessuti umani. Prima di tutto è la limitazione del tempo dopo la morte del feto prima della comparsa della dissociazione delle cellule e la raccolta. Questo problema può essere mitigato dalla programmazione prima di aborti elettivi e campioni di mantenere a 4 ° C. In secondo luogo, è importante cercare di identificare punti di riferimento per la dissociazione del tessuto corticale. A questo fine, è utile informare il medico che esegue la procedura abortiva per cercare di mantenere l'integrità del cervello, quando possibile. In terzo luogo, è importante rendersi conto che la scala del cervello fetale umano anche a 18-22 settimane supera di gran lunga anche quella di un topo adulto o di ratto e, quindi, la necessità di eseguire la dissociazione, la filtrazione e lavaggio con un sistema di throughput maggiore (ovvero articoli in plastica più grande, 10 ml pipette di plastica vs pipette in vetro lucido, più campioni trattati in parallelo). Quarto, le cellule sono dissociate meccanicamente e non è necessario per assicurarsi che tutti i frammenti di tessuto sono andati. Piuttosto è preferibile triturazione di minimizzare il più possibile, con l'intesa che la filtrazione rimuove i frammenti di tessuto indesiderati più grande e separato NSCs abbastanza individuale dal campione più ampio per la coltura. Quarto, i reagenti scelti sono ottimizzati per neurosfere umane. Infine, one dovrebbe cercare di non disturbare le singole cellule dopo che sono stati placcati, in modo da ridurre al minimo l'aggregazione.

Una volta che le cellule staminali neurali si sono formate sfere clonale, possono essere dissociate in singole cellule, come descritto sopra, e diversi passaggi per accertare le capacità di auto-rinnovamento o differenziate in diversi tipi cellulari con diverse combinazioni di fattori di crescita e / o proteine.