Generering av neuronala stamceller från kasserade mänskliga foster Bark-Tissue

1. Beredning av lösningar och material för dissekering och underhåll av neurala stamceller kultur

1. Förbered 100ml dissektion medium (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) i förväg och kyla.
2. Prepare100 ml odlingssubstrat (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) och förvara vid 37 ° C i ett vattenbad.
3. Förbered cell-frysning medium (KNOCKOUT DMEM/F12 10% FBS + 5% DMSO) för långsiktig frysförvaring av celler.
4. Om du vill kan förbereda 4% paraformaldehyd (PFA) för vävnad fixering.
5. Sterila, autoklaveras pincett och skalpell blad med handtag används för dissekering.
6. Ställ åt sidan en pipett gevär, 10 ml pipetter överföra och 40 mikroM cell sil (BD Falcon 352.340) för dissociation.
7. Avsätt flera 10 rätter cm kultur (BD) för dissektion, 50 ml centrifugrör (BD) för dissociation, 1,5 ml centrifugrör för mjukpapper lagring och frysta flaskor (BD) för att frysa celler.

2. Isolera mänskliga neurala stamceller från mänskliga fostrets hjärna

1. Skörd av livskraftiga vävnaden omedelbart efter uppsägningen av fostret är avgörande för framgången för förfarandet. För elektiva ingrepp, kan tidpunkten för att erhålla prover ordnas i förväg för att minimera tiden efter fostrets död. De produkter av befruktningen har skördats inom 2 timmar efter förfarande, men helst kan uppnås på elektiva ingrepp inom några minuter. Fostrets vävnader ofta splittrad. Men i allmänhet en betydande del av hjärnan förblir intakt för visuell identifiering. Begränsningar av gestationsålder (GA) bestäms av lagstadgad lag, men har utförts med hjälp av detta protokoll mellan 18-22 veckor GA.
2. Fostrets hjärna är placerad i en 10 ml petriskål med iskall KNOCKOUT DMEM/F12 lösning. Identifiera olika delar av hjärnbarken som anatomiska landmärken. Gränser för frontal-och parieto-occipital cortex är orienterade av extrapolerade skärningspunkten mellan centrala sulcus och Sylvian spricka. Dissekera vävnad från frontala cortex främre till den centrala sulcus och längs gränsen till Sylvian spricka med kirurgisk blad och se till att hålla ventrikeln intakt och oskadad.
3. Ta bort eventuella rester av blod och hjärnhinnor från den avskilda block av frontala cortex. Om provet är av tillräckligt god kvalitet, är det idealiskt att dissekera blocket i flera mindre prover för olika ändamål: avsnitt (fast i 4% paraformaldehyd, PFA) och protein / mRNA analyser (snabb frysta i -80 ° C).
4. Överför valda hjärnan blocket till en 50 ml centrifugrör och tillsätt iskallt KNOCKOUT DMEM/F12 lösning på ungefär 3 gånger i vävnaden volym. Försiktigt skilja vävnaden genom mekanisk pipettering med en 10 ml överföringspipett tills alla vävnader blir splittrad (i allmänhet 20-30 gånger) och sedan filtrera celler genom en 40 mikroM cell sil (BD Falcon 352.340) för att erhålla enstaka eller i närheten av en enda cell suspension.
5. Centrifugera cellsuspension vid 2000 rpm och rumstemperatur i 5 min, resuspendera cellpelleten i 10 ml färsk varm odlingsmedium (STEM Pro NSC SFM), och räkna antalet celler med en hemocytometer.
6. Tillsätt 5 ml varm odlingsmedium i varje 25 cm ² kulturen kolvar, och överföra 2x10 ⁶ celler till varje kolv. Kulturer hålls i ett 37 ° C / 5% CO ₂ inkubator för 1 vecka innan analysen. Ändra halv mediet en gång i veckan för vidare kulturer eller experiment.

3. Manipulaton av neurala stamceller för ytterligare karakterisering och experimenterande

1. Neurospheres bildar normalt i 1 till 2 veckor under de rekommenderade kulturen förhållanden med NSC diameter på mellan 200 och 400 ìm. Neurospheres i detta skede kan skiljas med 0,2 g / L EDTA på kalcium och magnesium gratis Hanks medium (Hanks) vid 37 ° C i 15 minuter för att erhålla enstaka celler. Celler fjädring spinns vid 2000 rpm, sköljas i färskt Hanks och replated i varma odlingsmedium för subkultur.
2. För att initiera differentiering, är dissocierade celler pläterade på poly-D-lysine/laminin 1 belagda täckglas vid en densitet av 1x10 ⁵ celler per täckglas (24mmX24mm). Oligodendrocyte differentiering uppnås genom att upprätthålla de celler med knockout DMEM/F12 (Invitrogen, Main, MD) +2% B27 (50X, Invitrogen, Main, MD) 10 ng / ml bFGF 100 ng / ml SHH + 10ng/ml PDGF-AA för 2dagar, sedan byta till samma medium utan tillväxtfaktorer i ytterligare 5 dagar. Neuronal differentiering uppnås genom att upprätthålla celler med knockout DMEM/F12 2% B27 (50X) i 7 dagar. Astrocyternas differentiering sker genom odling av celler med knockout DMEM/F12 +1% FBS i en vecka.
3. Transfektion av neurala stamceller med gener som kan göras med dissocierade celler från förformade neurospheres. Här visar vi de neurala stamceller transfekterade med EGFP-C1 med elektroporation. Den elektroporation av EGFP-C1 konstruera gjordes med hjälp AMAXA Nucleofector Kits för mus neurala stamceller (VPG-1004) med AMAXA Nucleofector Device (Lonza AAD-1001), efter bolagets instruktioner. Kort sagt, var 5 mikrogram DNA med 1 x 10 ⁶ celler blandas med 100 l transfektion medium, och efter att pulsen elektroporation var cellerna återsuspenderade i neurala stamceller behålla medel för vidare kultur. Differentieringen av transfekterade cellerna behandlas med dissociation av neurospheres 3-4 dagar efter elektroporation enligt samma förfaranden som beskrivs i steg 3,2.

4. Frysning neurala stamceller och subkulturer

1. Dissocierade cellsuspensioner centrifugeras och suspenderade i frysning medium med en koncentration av 1x10 ⁷ celler / flaskan / ml. Sakta frysa celler i -20 ° C, -80 ° C sedan överföra till flytande kväve för lång tids lagring.
2. Cellerna är snabba tinas upp med 37 ° C vattenbad och suspenderade i värmde DMEM/F12 10% serum för en tvätt, centrifugeras för att ta bort frysningen medium och suspenderade i det uppvärmda odlingsmedium.

5. Representativa resultat:

Neurala stamceller från ett normalt foster vid 18 veckors gestationsålder odlades efter de beskrivna metoderna och neurospheres kan ses efter en vecka med runda, mjuka gränser och ganska homogen storlek (Fig.2A). Dessa neurospheres kan transfererats med EGFP-C1 eller andra konstruktioner och följde i fluorescensmikroskopi (Fig.2B,). Etablerade neurospheres var då dissocierade med EDTA och klädd som utspridda celler på bestruket täckglas. Cellerna differentieras under respektive protokoll har fastställts med 4% parafamaldehyde och färgade med olika specifika celltyp markörer. Multipotentiality observeras med uttryck av markörer som tyder på nervceller (Fig2C, D, Rhodamine) astrocyter (Fig2E, F, Rhodamine) och oligodendrocyter (Fig2G, H, Rhodamine). Cellerna inte genomgått elektroporering av EGFP också differentieras till olika celltyper och färgat med olika cell-specifika markörer. Multipotentiality observeras med uttryck av markörer som tyder på nervceller (Fig3A, B, fluoroscein) astrocyter (Fig3C, Rhodamine och Fig3D, fluoroscein) och oligodendrocyter (Fig3E, F, Rhodamine).

Figur 1. Schematisk bild av den experimentella proceduren att isolera neuronala stamceller från kasserade mänskliga fostrets hjärna

Figur 2. Diverse och differentierade mänskliga neurala celler propogated in vitro. (A) Neurospheres redovisas under faskontrast mikroskopi visar släta, runda gränser och en snabb tillväxt efter kultur för över en vecka. (B) Införande av olika plasmider och konstruktioner kan uppnås genom transfektion. Tre dagar efter EGFP-C1 transfektion, flera celler visar uttryck av det grönt fluorescerande proteinet som ses under fluoroscein immunfärgning och fluorescensmikroskopi. EGFP-C1 transfekterade neurospheres är dissocierade och differentierade under olika förhållanden i neuron (C, D), astrocyter (E, F) och oligodendrocyter (G, H) och sett i Rhodamine fluorescens. Samtidigt är transfekterade EGFP positiva celler visas under fluoroscein fluorescens. Transfekterade celler (vita pilar) är omöjlig att skilja från untransfected celler (vita pilar). I cellkärnan finns färgas med Hoechst33342. Skala barer är 200 ìm för A, 100 ìm för B och 25 ìm för CH.

Figur 3. Neurospheres utan transfektion är dissocierade och differentierade under olika förhållanden i neuron (A, B, fluoroscein), astrocyter (C, Rhodamine, D, fluoroscein) och oligodendrocyter (E, F, Rhodamine). I cellkärnan finns färgas med Hoechst33342. Skala barer är 25 ìm för AF.

Det finns olika metoder mot kultur frisk vävnad och producera mänskliga cellinjer. Historiskt sett har färsk vävnad skördats och odlade omedelbart att generera olika typer av celler i centrala nervsystemet. Detta tillvägagångssätt är dock klart begränsad av det antal prover som kan erhållas-som i fallet för prover från människa, är oftast ganska liten. Med tanke på den minimala graden av manipulation, färska odlade neurala celler ger den mest tillförlitliga experimentella system genom att begränsa potentiella artefakter från utökad odling. Den begränsade utbudet ledde till en andra tillvägagångssättet att skapa mänskliga cellinjer som hade förevigat genom införandet av olika onkogener ^{12, 13.} Den oro för detta tillvägagångssätt låg i möjligheten att onkogena manipulation av dessa celler skulle förändra cellens egenskaper. Dessutom var en del av den logiska grunden för att generera humana cellinjer potentialen för transplantation och behandling av olika mänskliga sjukdomar. Förevigat cellinjer kan predisponera för risken för cancer tillväxt. Fördelen med dessa cellinjer är enhetliga linjer, deras förmåga att anta olika neuronala och gliaceller fenotyper inneboende i en region av hjärnan, och hur lätt generera ett stort antal kulturer. För att övervinna de potentiella onkogena begränsningar, har olika metoder använts för odling primära humana neurala stamceller. De flesta metoder är baserade på fonden och bFGF manipulering av celler, med vidhäftning eller avstängning tekniker kultur. Dessa olika synsätt resulterar i olika renhetsgrad av NSC ^14. Svendsen et al. rapporterade en metod för NSC kultur för del av bildade neurospheres med underhålls cell-cell kontakter (15), vilket kan ge en rik produktion av NSC på kort tid. Däremot kan oligodendrocyte inte erhållas med dessa neurospheres vid senare passager. Berikande neurospheres med fonden och bFGF kan också förändra transkriptionell och cellulära fenotyper in ^vitro-14. Användning av tidig passage kulturer ger en rimlig kompromiss mellan behovet av ett stort antal kulturer och minst oro för införandet av kultur artefakt. Nu senast har framsteg gjorts i generationen inducerade pluripotenta stamceller genom forcerad uttryck för en delmängd av gener som behövs för att bibehålla egenskaper som stamceller. IPS-celler har fördelen att ge stora mängder av mänskliga celler, samt potential att generera alla olika typer av celler som utgör den mänskliga kroppen. Just nu gör denna sista fördel även denna modell systemet mindre tilltalande i och med att signalering mekanismer för att omvandla cellerna till en viss celltyp (dvs. framhjärnan nervceller) inte är kända.

Den nuvarande metoder som beskrivs för generering av mänskliga NSCs ge några små variationer från andra publicerade metoder. De flesta tidigare metoder använder olika enzymatiska eller kemiska metoder för cell-dissociation (trypsin eller papain) för att skilja NSC från fostrets cortex. I allmänhet, med tanke på den stora mängd vävnad, använder vi skonsam mekanisk trituration med fin cell filtrering för att få livskraftiga enstaka celler som har genomgått minimal manipulation. Dessutom minimerar detta synsätt tiden från vävnaden skörd till vävnader odling / lagring, vilket är avgörande för prover från människa.

Detta protokoll beskriver hur man isolera mänskliga neurala stamceller från kasserade frontala kortikala vävnad ^7,9,10,11. Metoden för att isolera neurospheres varierar något mellan människa och mus, med den metod som beskrivs här är optimerad för att få encelliga upphängningar i humana vävnadsprover. Det finns flera överväganden vid användning av mänsklig vävnad. Först och främst är att begränsa tiden efter fostrets död före uppkomsten av cell dissociation och skörd. Detta problem kan minskas genom före schemaläggning av elektiva aborter och underhålla prover vid 4 ° C. För det andra är det viktigt att försöka identifiera landmärken för dissociation av kortikal vävnad. Mot detta syfte är det lämpligt att informera läkaren utför misslyckade förfarande för att försöka hålla hjärnan integritet när det är möjligt. För det tredje är det viktigt att inse att omfattningen av det mänskliga fostrets hjärna redan vid 18-22 veckor långt överstiger ens en vuxen mus eller råtta och därför behovet av att utföra dissociation, filtrering och tvättning med en större genomströmning systemet (dvs större plastartiklar, 10 ml plast pipetter vs glas polerad pipetter, flera prover bearbetas parallellt). Fjärde, cellerna är mekaniskt dissocierade och det är inte nödvändigt att se till att alla vävnads fragment är borta. Snarare är det att föredra att minimera trituration så mycket som möjligt, under förutsättning att filtrering tar bort det oönskade större vävnad fragment och separat nog enskilda NSCs från de större prov för odling. Det fjärde är de utvalda reagenser optimerad för mänskliga neurospheres. Slutligen, one ska försöka att inte störa enskilda cellerna efter att de har pläterade, för att minimera aggregering.

När mänskliga neurala stamceller har bildat klonat sfärer, de kan skiljas i enstaka celler som beskrivits ovan, och passerats att fastställa självförnyelse funktioner eller differentierade i olika celltyper med olika kombinationer av tillväxtfaktorer och / eller proteiner.